【佳学基因检测】为什么肿瘤基因检测除了全外显子组外，还需纳入miRNA基因检测？

肿瘤基因检测导读：

miRNA基因检测：

一般来说，microRNAs (miRNAs) 控制着 mRNA 的表达。然而，基因解码表明，miRNA 也能够靶向非编码 RNA，包括长链非编码 RNA 和 miRNA。后者，称为 miRNA:miRNA 相互作用，是一种自我调节形式。在《为什么肿瘤基因检测除了全外显子组外，还需纳入miRNA基因检测？》这篇科普介绍中，佳学基因解码讨论了 miRNA 的三种主要模式：miRNA 调控：直接、间接和全局相互作用，以及它们在癌症生物学中的意义。佳学基因解码还讨论了 miRNA:miRNA 相互作用的细胞类型特异性、当前的实验方法和生物大数据人工智能分析技术，以及这些策略如何不足以识别新的 miRNA:miRNA 相互作用。miRNA 的自我调节及其对基因调控的影响是佳学基因解码正在持续研究的一个新的领域。

miRNA基因检测关键词: 

RNA 调控, miRNA 调控, miRNA:miRNA 相互作用

因为它们对基因表达的影响、在身体组织和体液中的强大存在以及它们作为疾病生物标志物的潜在用途，MicroRNA (miRNA) 在基因解码的引领下，已经成为基础研究和临床应用的一个深度技术趋动机构的重点投入领域。这些小的非编码 RNA 的典型作用是通过 3' 非翻译区 (UTR) 中的识别位点影响信使 RNA (mRNA)，从而调节它们的稳定性。miRNA 主要通过靶向 mRNA 影响基因表达水平。miRNA 表达的任何变化都可能影响靶标调节的程度，从而影响细胞稳态。因此，miRNA 的相对水平以及由此而产生 mRNA的水平在时空及组织特异性中变化在癌症的发生、药物研究及其他疾病中具有不可忽视的作用。正因为此，佳学基因认为在肿瘤基因检测中，除了外显子组基因检测，还应纳入miRNA基因检测。

基因解码在miRNA肿瘤基因检测中作用在于它揭示出miRNA在人体细胞内由在细胞核和细胞质中的一系列切割阶段来产生。初级 (pri)-miRNA 转录物在细胞核中被微处理器切割，微处理器是由 Drosha 和 Di George 关键区域 8 (DGCR8) 组成的催化复合物 。miRNA基因解码进一步表明，通过 Drosha 与基础 UG 基序的相互作用以及 DGCR8 二聚体与顶端 UGU 基序的比对，茎环 pri-miRNA 正确定向指导切割。微处理器切割形成前体 (pre)-miRNA，通过 exportin-5 转运到细胞质中（Lund 等人，2004 年）。正是在这里，Dicer（也称为 DICER1）切割 pre-miRNA（Bernstein et al., 2001 )，得到的双链成熟 miRNA 随后被 Argonaute (AGO) 结合 ( Song et al., 2004 )。引导链仍然与 AGO 结合以形成 miRNA 诱导的沉默复合物 (miRISC)，而称为 miRNA* 搭载链（又称为过客链、乘客链）被去除和降解 ( Schwarz et al., 2003 )。

miRISC 的主要作用是启用 RNA 干扰 (RNAi) 途径，由此 miRNA 的种子区域，从 5' 端跨越 2-8 个核苷酸 ( Lewis et al., 2003 )，在 mRNA 的 3'UTR识别 Watson-Crick 互补结合位点 ( Lai, 2002 )。尽管成熟 miRNA 在细胞质中产生，但研究表明，多达 75% 的已知成熟 miRNA 同时存在于细胞核和细胞质中（Gagnon 等人，2014 年）。核 miRNA、它们的核输入机制和调控作用虽然已被基因解码分析，但不是本文要介绍的内容。请在佳学基因官网采用适当的关键词搜索相关内容。

尽管 miRNA 的主要作用是进行转录后基因调控，但它们对其他非编码RNA的控制成为基因解码对人体基因信息深入、全面和准确了解的一个重要来源。基因信息的解码和解密研究已发现 miRNA 与长链非编码 RNA (lncRNA)、环状 RNA (circRNA) 和假基因相互作用，以诱导 miRNA 抑制或增加细胞对 miRNA 结合位点的竞争（Gebert 和 MacRae，2019；Ransohoff 等，2018；乌利茨基，2018 年）。在"为什么肿瘤基因检测除了全外显子组外，还需纳入miRNA基因检测？"中，佳学基因解码总结了最近的研究，这些研究证明了 miRNA 实际上如何调节非编码 RNA，特别关注它们对其他 miRNA 的控制。通过另一种 miRNA 进行 miRNA 调控的分子过程以前被称为 miRNA:miRNA 相互作用（Hill 和 Tran，2018）。在"为什么肿瘤基因检测除了全外显子组外，还需纳入miRNA基因检测？"中，佳学基因解码讨论了 miRNA:miRNA 相互作用背后的机制、它们在癌症发病机制中的作用以及当前研究方法的中需要进一步深入和改进的地方。有关 miRNA 与其他非编码 RNA 相互作用的更多信息，佳学基因解码向读者推荐关于该主题的其他内容（Fabbri 等人，2019 年；Grillone 等人，2020 年；Ulitsky，2018 年；Anastasiadou 等人，2018 年）。

miRNA的发现：miRNA相互作用

果蝇中的互补 miRNA对于 2004 年首次被注意到，Watson-Crick 结合用于鉴定 miR-5 和 miR-6 之间以及 miR-9 和 miR-79 之间的配对。预计这些 miRNA 对之间的结合比指导 miRNA 和过客 miRNA* 链之间的结合更强（Lai 等，2004）。本研究的作者和其他研究小组提出，互补 miRNA 对的形成会增加它们的稳定性，或阻止靶点调节（Lai 等人，2004 年；Guo 等人，2012 年）。

这些 miRNA 对的鉴定是基于序列分析，并没有在体外得到证实。然而，这项研究在理论上确立了 miRNA 可以与其他 miRNA 和非编码 RNA 结合，并提出这可能如何改变稳态基因调控 ( Lai et al., 2004 )。下面讨论的后续工作已经确定了在几种不同机制下在体外发生的 miRNA:miRNA 相互作用。miRNA：miRNA 相互作用对细胞功能具有广泛的影响，并且被认为为 miRNA 和 mRNA 调节增加了另一层。

直接 miRNA:miRNA 相互作用

正如该术语所暗示的，当一个 miRNA 以互补方式结合另一个时，就会发生直接的 miRNA：miRNA 相互作用。这已在细胞质中的两个成熟 miRNA 之间得到证实（Chen 等人，2011；Lai 等人，2004），或涉及细胞核内的成熟和 pri-miRNA（Forrest 等人，2010；Tang 等人） ., 2012 ; Wang et al., 2018a ; Zisoulis et al., 2012 ) (图。1）。

图。1。

直接 miRNA：miRNA 相互作用。这些发生在细胞质中的两个成熟 miRNA 之间或细胞核中的成熟和初级 miRNA 发夹之间。这些核相互作用通常会阻止微处理器的结合，从而阻止初级 miRNA 的成熟，降低其水平并阻止其靶 mRNA 的沉默。两个成熟 miRNA 之间的细胞质相互作用是序列特异性的，并将两个 miRNA 结合的 RNA 诱导的沉默复合物 (miRISC) 结合在一起。然而，这种相互作用对 miRISC 活动的功能后果尚不完全清楚。

作用机制

一些研究已经调查了 miRNA 之间的直接结合作为 miRNA:miRNA 相互作用的一种模式。其中第一个确定 miR-424 和 miR-503 都通过其 pri-miRNA 形式的识别位点直接调节 miR-9（Forrest 等，2010）。虽然没有直接说明，但 pri-miR-9 的靶向意味着这种特殊的相互作用发生在细胞核内。miR-424 和 miR-503 都被归类为分化 miRNA，这意味着它们促进细胞分化，而 miR-9 是抗分化的。因此，miR-424 和 miR-503 对 miR-9 的下调抑制了其将细胞维持在未分化状态的能力，并促进了细胞谱系的定型和生长（Forrest 等，2010）。

在小鼠中的一项关键发现，即 miR-709 在细胞核中结合 pri-miR-15a/16-1 以调节其产生（Tang 等人，2012），引入了 miRNA 层次结构的概念，其中初始组的特定 miRNA 负责 miRNA 的广泛转录后控制。这会诱导二级 miRNA 的表达，以继续转录后调控的级联。该研究还表明，miRNA:miRNA 相互作用可以影响生物发生途径，从而改变 miRNA 的产生 ( Tang et al., 2012 )。

Zisoulis 等人在一次交流中发现了 miRNA 的几个重要方面：miRNA 相互作用。（2012 年）。本研究表明，成熟的秀丽隐杆线虫miRNA let-7可以结合并调节pri-let-7促进其产生，形成正反馈回路（Zisoulis et al., 2012）。由于初级 miRNA 的切割发生在细胞核中，这一发现表明成熟的 miRNA 可以迁移到细胞核中发挥其调节作用，从而引发对核 miRNA 的进一步研究（Zisoulis 等，2012；Liang 等，2013）。此外，这项研究还表明，miRNA 可以通过控制其未成熟形式来调节自身的产生。因此，miRNA:miRNA 相互作用可能在自动调节中起作用。

两项关注 miRNA:miRNA 相互作用的研究表明，成熟 miRNA 与 pri-miRNA 的识别和结合会阻碍微处理器的附着并阻止 pri-miRNA 切割，从而降低其丰度。对鼠心肌细胞的分析发现，pri-miR-484 序列在其转录本中含有一个 miR-361 的结合位点，这种结合阻止了 pri-miR-484 在细胞核内被Drosha切割，从而阻止了心肌细胞凋亡。等人，2014 年）。最近的一份报告发现，通常在肝脏中表达的 miR-122 通过控制其初级转录物的表达来调节 miR-21 ( Wang et al., 2018a)）。pri-miR-21 转录本中的 miR-122 识别位点位于 Drosha 识别的区域内，miR-122 与 pri-miR-21 的结合阻断了 Drosha 介导的切割和加工，最终减少了成熟 miR-21 的数量。 21 在细胞内 ( Wang et al., 2018a )。这种机制对细胞生长和增殖具有重要意义，因为 miR-21 是已知的肿瘤抑制因子程序性细胞死亡 4 (PDCD4) 的调节因子（Lu et al., 2008 ; Wang et al., 2018a）。这在肝癌小鼠模型中最为明显，其中与野生型 pri-miR-21 相比，添加 miR-122 和突变 pri-miR-21 增加了肿瘤生长。在这种情况下，pri-miR-21 的突变阻止了 miR-122 定向下调，并增加了总体 miR-21 水平以促进肿瘤发展（Wang 等人，2018a）。这些 pri-miRNA 序列中 miRNA 结合位点的例子表明，作用于细胞核的 miRNA 可能会干扰 miRNA 的产生，尤其是通过阻断 Drosha 切割。这可能表明调节和协调 miRNA 表达的更广泛的机制。

另一种直接 miRNA:miRNA 相互作用的方式是通过识别两个成熟 miRNA 内的互补序列。例如，miR-107 与抑制肿瘤的 miRNA let-7 内的互补序列结合，从而抑制成熟的 let-7。这两个成熟的miRNA形成的双链在其结构中具有一系列凸起，其中内部环对于相互作用至关重要（Chen et al., 2011）。然而，这种相互作用引发了关于两个成熟 miRNA 在被 miRISC 结合时如何进行结合以及 miRISC 成分的作用的问题。一项研究表明，Argonaute 2 (AGO2) 中的氨基酸残基可以让 miRNA 与非规范靶标结合并有助于 miRNA 合作（Flamand et al., 2017）。虽然这尚未在 miRNA:miRNA 相互作用的背景下进行测试，但可能是这种机制负责结合两个 AGO2 复合物。此外，一些关于 miRNA:miRNA 相互作用的研究提出了它们可能增加 miRISC 稳定性的观点。与目标的规范结合通常会导致 miRISC 稳定，而非规范结合会导致其不稳定（Park et al., 2017）。因此，两个 miRNA 的直接结合可能有助于稳定和防止 miRNA 降解。

这些例子显示了 miRNA:miRNA 相互作用的可变性，并提出了与 pri-miRNA 和成熟 miRNA 之间这种调节模式的程度有关的问题。此外，核 miRNA 执行转录后沉默的精确机制，包括其他 miRNA 的机制（Tang 等人，2012 年；Wang 等人，2018a，2014 年；Zisoulis 等人，2012 年）)，仍有待充分理解。由于多项研究描述了成熟 miRNA 与 pri-miRNA 链的结合，这种结合机制可能代表了一种尚未彻底探索的更广泛的 miRNA 调节模式。两个成熟 miRNA 结合背后的机制以及它如何调节两个 miRNA 的 RISC 成分也尚未得到解释。

对疾病的影响

几种直接的 miRNA:miRNA 相互作用与疾病发展有关。成熟的 let-7 miRNA 受 miR-107 控制。因为 let-7 是一种肿瘤抑制因子，它的下调和 miR-107 的抑制导致其靶癌基因的丰度增加，有助于下游肿瘤发生 ( Chen et al., 2011 )。同样，由于 miR-484 在心肌细胞凋亡中的作用 ( Wang et al., 2012 )，miR-361 和 miR-484 之间的直接相互作用对心肌梗塞等心脏病具有影响 ( Wang et al., 2014 ) . 此外，miR-503 和 miR-484 对 pri-miR-9 的下调促进了细胞谱系的确定（Forrest 等人，2010）。如果这种相互作用被破坏，miR-9就会上调，导致癌细胞典型的未分化状态。

另一种致癌 miRNA，miR-21，在大多数实体恶性肿瘤中过度表达。在非癌性肝细胞中，miR-21 处于 miR-122 介导的抑制作用下，这会增加 miR-21 靶基因PDCD4的表达，从而控制细胞增殖。然而，如果 miR-122 调节缺失，miR-21 表达增加，导致 PDCD4 水平下降，从而导致癌症表型（Lu 等人，2008 年；Wang 等人，2018a）。miR-21 上调影响细胞增殖和大小，并允许癌细胞继续生长和存活。因此，miR-122 和 pri-miR-21 之间的 miRNA:miRNA 相互作用对于控制细胞稳态、细胞周期和预防致癌变化至关重要。

由于讨论的许多 miRNA:miRNA 相互作用涉及将成熟 miRNA 运输到细胞核以调节 pri-miRNA，因此确定 miRNA 运输是否在癌细胞中发生改变非常重要。中断 miRNA 的核输入将阻止 pri-miRNA 靶向，并可能改变其靶 miRNA 和 mRNA 的表达，从而增加致癌改变的级联。这方面的一个例子已经被证明，其中 importin 8 的敲低阻止了 miR-709 转运到细胞核中，随后增加了 miR-15a/16-1 的水平 ( Wei et al., 2014）。建议进一步研究确定 miRNA 在癌细胞中与正常生理水平相比的核和细胞质分布，以评估是否对 miRNA 和 mRNA 表达有影响。

间接 miRNA:miRNA 相互作用

尽管讨论的几项研究表明 miRNA 能够在其生物发生的不同阶段直接调节 miRNA，但 miRNA:miRNA 相互作用也可以通过间接方式发生。图 2）。

图 2。

间接 miRNA：miRNA 相互作用。这些相互作用是通过 miRNA 定向抑制 miRNA 生物发生途径成分或转录调节因子而发生的。生物发生成分的抑制对特定 miRNA 的产生产生影响，而不是对整体 miRNA 产生的预期负面影响。靶向转录调节剂可能包括转录因子、DNA甲基转移酶和阻遏物。

转录因子的作用

一种这样的 miRNA:miRNA 相互作用途径是转录控制及其对 miRNA 产生的影响。在该模型中，miRNA 靶向编码转录调节因子（如转录和甲基化因子）的 mRNA 的 3'UTR，以诱导其表达发生变化。通过这种方式，一个 miRNA 可以通过作为基因调控网络的一部分控制其转录或调控途径来调节另一个 miRNA 的表达（Song et al., 2015）。因此，这种 miRNA:miRNA 相互作用是由二级转录控制引起的，而不是直接相互作用。

这种调节网络的第一个例子在小鼠成年心肌细胞中得到证实，其中 miR-208a 调节了 miR-208b 和 miR-499 的转录 ( van Rooij et al., 2009）。在这里，miRNA 编码在各种肌球蛋白基因的内含子中。在快速肌球蛋白基因中编码的 miR-208a 能够负调节负责沉默含有 miR-499 和 miR-208b 的慢速肌球蛋白基因转录物表达的阻遏物。miR-208a 的增加会降低慢肌球蛋白基因抑制因子的可用性，从而降低 miR-499 和 miR-208b 的上调。在心脏中，miR-208b 上调需要额外存在压力信号，例如钙或甲状腺功能减退，但 miR-499 的激活不需要外部刺激。这些 miRNA 的增加通过靶向阻遏物诱导慢肌基因的表达。慢肌基因的激活放大了包含 miR-499 和 miR-208b 的基因表达的信号。van Rooij 等人，2009 年）。这是第一个通过 miRNA 介导的转录因子和阻遏物控制引入 miRNA 调节概念的研究（van Rooij 等人，2009 年；Zhang 和 Zeng，2010 年）。

已经发现了一个涉及 miR-20a 和 E2 因子 (E2F) 家族的转录因子的自动调节环，它们是重要的细胞周期和细胞凋亡调节剂。在这种反馈机制中，含有 miR-20a 的 miR-17-92 家族调节 E2F 基因的表达 ( Sylvestre et al., 2007 )。同时，E2F 成员 E2F1、E2F2 和 E2F3 通过与其启动子结合激活 miR-20a 的表达。通过这种方式，miR-20a 水平的增加抑制了 E2F 转录因子的产生，随后降低了 miR-20a 转录。作者提出，这种机制的主要作用是调节 E2F 基因的表达以防止细胞凋亡 ( Sylvestre et al., 2007）。然而，这个反馈回路也突出了转录因子介导的间接 miRNA 自动调节。

最近对肺癌细胞的一项研究发现，肿瘤抑制因子 miR-660-5p 通过小鼠双分钟 2 (MDM2) 和 p53 (也称为 TP53) 控制 miR-486-5p 的表达 ( Borzi et al., 2017 ) . 在该模型中，miR-660 沉默其直接靶标MDM2，从而导致 p53 增加（Borzi 等人，2017 年）。因为 p53 是一种参与 miRNA 生物发生的转录因子，并且是一种有效的肿瘤抑制因子，它在 MDM2 沉默时的激活会启动 miR-486-5p、miR-29 和 miR-34 家族的转录（Borzi 等人，2017） . 因此，该网络通过它们对转录调控的控制证明了 miRNA:miRNA 调节的更广泛影响。

除了调节转录因子外，miRNA 还可能通过诱导表观遗传标记的变化来影响其他 miRNA 的产生。一项对舌鳞状细胞癌组织的研究表明，miR-29b 下调 DNA 甲基转移酶基因DMNT3B，进而改变 miR-195 启动子的甲基化模式。这诱导了 miR-195 产生的增加，产生了一个正调节系统，其中 miR-29b 的上调增加了 miR-195 的水平。由于这两种 miRNA 都是在癌症中下调的肿瘤抑制因子，这种机制可能为舌鳞状细胞癌提供治疗窗口（Jia et al., 2016）。这些例子展示了通过转录因子、启动子和表观遗传学间接控制 miRNA 如何对 miRNA 表达产生更广泛的影响，以及影响包括癌症发展在内的多种细胞途径的能力（Ali Syeda 等人，2020 年）。

miRNA生物发生成分的作用

miRNA 可以调节 miRNA 生物发生途径成分的表达，这些成分已被证明会影响几种 miRNA 的产生，并且可能会影响细胞系统中 miRNA 的整体丰度。一项针对上皮性卵巢癌的研究表明，miR-98-5p 可以通过靶向 Dicer 的 mRNA 转录物来调节 miR-152 的表达，形成间接的 miRNA:miRNA 相互作用（Wang et al., 2018b）。该研究表明，miR-152 水平会随着 miR-98 过表达和 Dicer 敲低而发生变化。然而，由于 Dicer 参与该途径，预计该系统中大多数 miRNA 的表达水平会发生变化（Song 和 Rossi，2017 年），并且这种调节方式将不限于 miR-152 .

另一项研究还调查了涉及生物发生途径成员 AGO2 的间接 miRNA：miRNA 相互作用（Leonov 等人，2015 年）。在人真皮淋巴管内皮细胞中，当被肉豆蔻酸佛波醇 (PMA) 激活时，miR-132 会抑制 AGO2。相反，抑制 miR-132 会导致 AGO2 增加。miR-132 的 PMA 激活还导致 miR-221 减少和 miR-146a 增加，随后抑制 miR-132 使 miR-221 和 miR-146a 升高。这些 miRNA 表现出随着 AGO2 的降低而降低成熟与前 miRNA 的比率，这意味着它们的成熟链不太丰富（Leonov 等人，2015）。然而，该研究还强调，其他调节机制也可能有助于观察到 miR-221 和 miR-146a 的变化（Leonov 等人，2015 年）。这些 miRNA 之间的相互作用对炎症和血管生成有影响，因为促血管生成 miR-132 促进了抗血管生成 miR-221 的减少和炎症 miR-146a 的增加（Leonov 等，2015）。

这些发现强调，尽管 miRNA 本身对 miRNA 生物发生途径成分的下调可能导致 miRNA 丰度的整体下降，但研究人员更普遍地观察到这种机制仅影响选定的 miRNA。对于生物发生途径的几个成员，例如 Drosha，miRNA 靶位点尚未经过实验验证（Chou 等人，2018 年；Kishore 等人，2011 年）。有人建议，如果 Drosha 受到 miRNA 的负调控，由于其在 miRNA 产生中的关键作用，这将对 miRNA 组产生影响。在文献中也很明显，对 miRNA 的改变及其产生对细胞相互作用和功能的总体影响缺乏了解。

对癌症的影响

几种 miRNA：miRNA 相互作用被整合到对癌症进展至关重要的途径中。这种相互作用包括 miR-205 和 miR-184 之间的相互作用，其介导含有脂质磷酸酶 SH2 的磷酸肌醇 5'-磷酸 2 (SHIP2；也称为 INPPL1) 的水平 ( Yu et al., 2008 )。这两种 miRNA 在SHIP2的 3'UTR 内具有重叠的结合位点，由此 miR-184 通过阻止进入结合位点而不诱导调节来介导 miR-205 驱动的 SHIP2 抑制。然而，在癌症中观察到 miR-205 的增加和 miR-184 的减少，这也降低了 SHIP2，特别是在角膜鳞状细胞癌中（Yu et al., 2008）。由于 SHIP2 参与 AKT 通路，这对细胞增殖、生长和凋亡有影响，这意味着这种 miRNA:miRNA 相互作用是癌症表型的主要贡献者。

先前描述的涉及 miR-660-5p、MDM2 和 miR-486-5p 的 miRNA：miRNA 相互作用被提议通过稳定肿瘤抑制因子 p53 作为肺癌治疗的潜在靶标（Borzi 等，2017）。除其他功能外，p53 还参与 PI3K-AKT 通路，并且通常在癌症中失调。因此，该途径的破坏会导致 p53 不稳定，从而对癌症发展产生下游影响。博尔齐等人。(2017)提出诱导 miR-660-5p 可能是一种潜在的治疗方法，因为它对 MDM2 的抑制将有效地稳定 p53，减少肿瘤生长。

同样，miR-98 和 miR-152 通过上文讨论的 Dicer 调节的间接相互作用（Wang 等人，2018b）对上皮性卵巢癌的化疗耐药性有影响。在这种癌症类型中，观察到高水平的 miR-98 和低水平的 miR-152，这导致 DNA 修复基因RAD51的上调，促进了化疗耐药性 ( Wang et al., 2018b )。小鼠体内模型显示，与仅用 miR-152 或顺铂治疗的肿瘤相比，用 miR-152 和化疗剂顺铂治疗的肿瘤明显更小，细胞增殖减少（Wang et al., 2018b）。该研究表明，miRNA:miRNA 相互作用也有助于癌细胞的形态学和抗治疗特性。

已发现致癌 miRNA miR-21 参与多种 miRNA:miRNA 相互作用；例如，通过间接调节结肠癌中 miR-145 的表达来维持致瘤性变化（Yu et al., 2015）。miR-21 的增加启动 K-Ras 信号传导，激活转录因子 Ras 反应元件结合蛋白 (RREBP；也称为 RREB1)，进而抑制 miR-145 的转录 ( Yu et al., 2015 )。因此，在癌症中观察到的 miR-21 的增加导致 miR-145 的表达降低，从而放大了致癌变化。此外，miR-21 水平受 miR-122 靶向其初级链的影响，以防止肝细胞的致癌变化（Wang 等人，2018a）。

全球 miRNA:miRNA 相互作用

我们已经讨论了一个 miRNA 可以调节其他几个或整个 miRNA 家族的表达的想法（Borzi 等人，2017）。然而，很少有研究关注 miRNA 对细胞系统中全局 miRNA 表达的影响。图 3）。

图 3。

全局 miRNA：miRNA 相互作用是由于细胞内控制 miRNA 表达的反应达到顶点。这些考虑了 miRNA 和 mRNA 表达的所有直接和间接变化，以响应 miRNA 表达的扰动。全面理解 miRNA 的复杂性：细胞系统中的 miRNA 相互作用涉及多种机制的整合，以及对 miRNA 和 mRNA 的继发性变化的考虑。

在Matkovich 等人的开创性研究中，高阶 miRNA：miRNA 相互作用在小鼠心脏细胞中得到解决。(2013) , 其中下游 miRNA 和 mRNA 变化是针对 miR-499 和 miR-378 进行测量的。miR-499 的转基因过表达上调了 11 个 miRNA，下调了 6 个 miRNA，而 miR-378 上调了 18 个 miRNA，下调了 31 个 miRNA。结果表明 miR-499 和 miR-378 都影响其他心脏 miRNAs 的转录，尽管不是直接的，因为目标 miRNAs 的稳定性和引导-乘客链比没有受到影响 ( Matkovich et al., 2013)）。在受影响的 miRNAs 中，有 13 个在 miR-499 或 miR-378 直接靶向的基因内编码，因此在转基因模型中被共同调控，这解释了一小部分受调控的 miRNAs 背后的机制。提示 miRNA 的其余变化是 miR-499 和 miR-378 靶标失调的结果。值得注意的是，miR-378 抑制 MAF 和 RORA 转录因子，导致 miR-99 减少。因此，31 个 miR-99 靶标被 miR-378 间接解除调控（Matkovich et al., 2013）。作者还发现，在 miR-499 模型中，76 个下调的 mRNA（7.8%）是 miR-499 的靶标，298 个（31%）是上调的 miRNA 的靶标。有人提出剩余的 595 个（75%）下调的 mRNA 是继发性 miRNA 变化的结果。这是该领域的一项重要研究，因为它确定了 miRNA 水平的变化对 miRNA 环境具有全球影响，导致继发性 mRNA 和 miRNA 变化。因此，这项研究拓宽了我们对驱动间接 miRNA:miRNA 相互作用的机制的理解。

正如我们上面所讨论的，已经研究了 miRNA 通过它们对 miRNA 表达的影响来间接调节靶转录物。沙哈布等人。(2012)在卵巢癌细胞中过表达 miR-7，并分析了 miRNA 和 mRNA 表达水平的变化。他们确定了细胞环境中的二级调控基因 ( Shahab et al., 2012）。然而，问题仍然在于 miRNA 的引入如何以间接和直接的方式影响下游 miRNA 水平。关于单个 miRNA 变化对 miRNA 组的更广泛影响已经出现了几种理论，包括 miRNA 基因组编码区下游启动子活性的变化、失调基因中包含 miRNA 序列或转录因子活性改变的影响（Shahab等人，2012 年）。

最近的研究观察到，一种 miRNA 可以调节另一种 miRNA 的表达，以放大对共同靶点的调节作用。肺动脉高压中 miR-130/301 家族表达水平升高，导致 miR-204、miR-322 和 miR-503 通过过氧化物酶体增殖物激活受体 γ (PPARG) 和信号转导和转录激活因子 3 降低。 STAT3) ( Bertero et al., 2014）。在缺氧条件下，miR-130/301 家族的升高导致 PPARG 有针对性地降低。在肺动脉平滑肌细胞内，这会导致 STAT3 升高，从而导致 miR-204 表达降低，从而导致细胞增殖增加。此外，在肺动脉内皮细胞中，PPARG 抑制 apelin 以及 miR-424 和 miR-503，也增加了细胞增殖。这两种途径共同促进内皮细胞和平滑肌细胞增殖，导致肺动脉高压表型。在 miRNA 中观察到的变化及其对细胞增殖的影响表明，许多 miRNA 可能协同作用以驱动分子变化，从而产生比单个 miRNA 的作用更大的影响（Bertero 等人，2014）。

miRNA 协同作用的概念意味着存在“主调节剂”miRNA，一种影响细胞系统内大多数 miRNA 的 miRNA。因此，主调节 miRNA 表达的任何变化也会改变其协同网络中的 miRNA。同样，靶向转录调节因子的 miRNA 可能会改变功能相似的 miRNA 的转录活性，以帮助协调反应 ( Ooi et al., 2017 )。

然而，很少有研究调查这种 miRNA:miRNA 相互作用现象，尤其是在癌细胞中。鉴于其对 miRNA 和 mRNA 环境的巨大整体影响，主调节因子和协同 miRNA 的变化可能对细胞产生可怕的后果，并可能影响癌症中改变的许多细胞途径。因此，重要的是在癌细胞系统中研究全局 miRNA:miRNA 相互作用。

miRNA：疾病中的miRNA相互作用

上述章节中讨论的许多例子已经在癌症的背景下进行了观察和测试。然而，关于 miRNA:miRNA 相互作用的性质、它们失调背后的机制以及对它们在化疗耐药背景下影响的理解，仍然存在几个问题。

细胞类型的排他性

鉴于 miRNA 和 mRNA 表达与细胞类型相关，可以假设 miRNA:miRNA 调节网络也传达了这种特异性。核 miRNA 分布也由细胞类型决定，因此延伸到核 miRNA:miRNA 相互作用的范围（Salmanidis 等人，2014 年）。当前的预测算法没有考虑到这种区别（Rock et al., 2019）。因此，来自 miRNA:target 相互作用数据库的信息可能无法传达所研究的细胞类型，这可能导致在挖掘数据时得出不准确的结论。这些不准确性也会影响用于绘制 miRNA:miRNA 网络的基因和 miRNA。来自一种细胞类型的网络不能用于推断另一种细胞类型。目前，目标信息的细胞特异性和miRNA预测是一个正在进行的研究领域，挖掘现有数据库的研究人员应该将细胞特异性作为关键因素考虑。

失调背后的机制

目前，对于癌症中 miRNA 的失调，还没有一种理论或机制。考虑到生理系统的复杂性，可能有多种机制在起作用，包括那些涉及 miRNA 生物发生成分、转录因子调控和 miRNA 链内突变的机制。

miRNA 生物发生途径成分的异常会影响 miRNA 的表达。最近的一份报告显示，Dicer 的 RNase IIIb 结构域内的突变耗尽了 5p 链 miRNA，这影响了 3p 与 5p 成熟 miRNA 的比率（Vedanayagam 等人，2019 年）。3p 与 5p 比率的改变改变了靶向基因的谱，例如在子宫内膜癌中，具有 Dicer 突变的患者的基因被解除抑制，这些基因包含富含 let-7、miR-17、miR-15/16、 miR-29 和 miR-101 家族。尽管罕见，但在其他几种癌症（包括膀胱癌、肾癌和子宫癌）中也观察到 Dicer 突变，并且可能仅在特定组织中提供选择性优势（Vedanayagam 等，2019）。这项研究提出了 miRNA:miRNA 网络如何响应链选择的变化而改变的问题，因为这会影响靶基因和下游转录因子和 miRNA 的表达。

同样重要的是要考虑抑制 miRNA 转运进入细胞核是否会影响 miRNA 靶向 pri-miRNA 或基因启动子的程度。在 exportin-5 功能丧失突变的情况下，pre-miRNA 无法运输到细胞质中，导致成熟 miRNA 水平下降（Kim et al., 2016）。因此，假设成熟 miRNA 的减少可能会影响两个细胞区室中的 miRNA:miRNA 相互作用，从而导致癌症表型 ( Hata and Kashima, 2016 )。

在全基因组范围内，超级增强子的丢失或获得对 miRNA 和基因表达有广泛的影响，超级增强子是包含多个增强子元件并共同结合多个转录因子的基因组位点（Suzuki et al., 2017）。在正常生理条件下，超级增强子控制决定细胞类型的基因和 miRNA 的转录。如果改变，这会导致细胞特异性丧失，这是典型的致癌作用（Matsuyama 和 Suzuki，2019 年）。决定细胞类型的 miRNA 的减少导致先前以较低水平表达的 miRNA 的增加。因此，这种改变的 miRNAome 控制了一组不同的基因，进一步增加了潜在的致癌变化 ( Li et al., 2018）。通常，超增强子区域的缺失会导致肿瘤抑制 miRNAs 的增加，而超增强子的增加会丰富致癌 miRNAs ( Suzuki et al., 2017 )。因此，未来对 miRNA:miRNA 相互作用的研究必须在系统范围内进行，以更好地了解 miRNA 表达及其靶标可能发生的变化（Matsuyama 和 Suzuki，2019 年）。

另一个驱动 miRNA 表达变化的因素是其种子区域内的单核苷酸多态性 (SNP) ( Lewis et al., 2003 )。种子序列对于与目标 mRNA 或目标识别序列的结合是必不可少的。对这些域中的任何一个进行更改都可能导致失去目标调节。此外，不同的 miRNA 异构体 (IsomiRs) 可以通过添加来自 miRNA 的 5' 或 3' 末端的核苷酸来改变种子区域。IsomiR 对基因靶向有影响，并在疾病发展中发挥作用（Bofill-De Ros 等人，2020 年）。改变种子区域的 SNP 或 IsomiR 的存在有可能改变 mRNA 和 miRNA 的表达，这将对细胞环境产生级联效应（Króliczewski 等，2018）。miRNA 种子序列参与 miRNA:miRNA 相互作用的程度目前尚不清楚。然而，有人认为该区域的改变可能会破坏 miRNA-mRNA-miRNA 网络。

协助开发疗法

了解 miRNA 之间的相互作用及其对基因表达的影响对于探索潜在的癌症疗法及其脱靶效应是不可或缺的（Lapa 等人，2019 年）。一些关于 miRNA:miRNA 相互作用的报告研究了这些网络在它们对化学治疗剂的反应的背景下，例如对 Erb-B2 受体酪氨酸激酶 2 (ERBB2) 抑制剂曲妥珠单抗在乳腺癌中的反应 ( Cilek et al., 2017 )，卵巢癌中的顺铂耐药 ( Wang et al., 2018b ) 或实验性抗 miRNA 药物，如 miR-34 ( Ooi et al., 2017）。进一步研究 miRNA:miRNA 在癌症和其他疾病中的相互作用将有利于我们对这些疾病的机制理解，并有助于确定可行的治疗靶点。

生物信息学的作用

生物信息学方法在研究 miRNA:miRNA 相互作用的影响方面发挥了重要作用。一些研究将与基因、miRNA 和 lncRNA 相互作用相关的数据库结合在一个网络中（Liu 和 Ye，2019；Ulitsky，2018；Zhao 等人，2008）。这使人们对可能导致疾病的编码和非编码遗传因素有了更深入的了解。

例如，当给定的 miRNA 改变 mRNA 的表达时，这可能反过来改变下游 miRNA 的表达。miRNA-mRNA-miRNA 网络的形成可用于识别控制网络内大多数 miRNA 表达的主调节 miRNA（Hu et al., 2020 ; Ooi et al., 2017），例如 miR- 1 已使用生物信息学鉴定为前列腺癌中潜在的主要调节 miRNA（Alshalalfa，2012 年）。显然，生物信息学是理解不同 RNA 种类之间相互作用以及识别主调节 miRNA 和 miRNA 层次结构的重要技术方法（Bertero 等，2014）。

miRNA 之间的相互作用也已通过识别具有重叠子通路的那些来确定（Wu et al., 2013）。在这里，作者使用计算工具表明 miR-21 与下调的 miRNA 的联系比与上调的 miRNA 的联系更多。同样，这可能会影响分析中 miR-21 和其他 miRNA 参与的直接途径，但也会通过这些 miRNA 间接影响其他亚途径（Wu et al., 2013）。

然而，需要持续考虑的一个问题是缺乏与 miRNA 和 mRNA 表达和相互作用的细胞特异性有关的信息。这包括存在于细胞核和细胞质中并具有活性的 miRNA，以及细胞特异性 IsomiR ( Salmanidis et al., 2014 )。当前预测 miRNA 结合的算法，例如 miRanda ( Betel et al., 2010 )，没有考虑组织或细胞的起源类型，这可能会扭曲生物信息学和实验分析 ( Rock et al., 2019 )。miRNA 序列的细胞特异性变异也为 miRNA 靶标和 miRNA:miRNA 相互作用的鉴定增加了额外的复杂性（Glogovitis 等人，2021）。此外，仅基于生物信息学分析的发现应通过体外实验得到证实（Liu 和 Ye，2019 年）。

许多研究 miRNA 对控制细胞过程的更广泛影响的研究使用 miRNA 测序 (miRNAseq) 或 miRNA 阵列方法。目前的阵列方法只能识别具有高置信度的注释 miRNA，而 miRNAseq 已被用于识别新的 miRNA 和 IsomiR，尤其是细胞类型特异性的那些。因此，与 RNAseq 配对，miRNAseq 是确定 miRNA 变化及其各自靶标水平的首选方法，随后可用于网络分析。

如前所述，一些直接的 miRNA:miRNA 相互作用涉及成熟 miRNA 识别 pri-miRNA 链内的结合区域（Tang 等人，2012；Wang 等人，2018a；Zisoulis 等人，2012）。虽然 miRNA 的前体序列是已知的并且注释很好，但每个 miRNA 的一级序列的序列相对未知。许多研究试图定义 pri-miRNA 序列库，但由于 pri-miRNA 的高度瞬态性，这已被证明是困难的，有几项研究使用了 Drosha 依赖的测序协议 ( Kim et al., 2017 )。目前，多达 20% 的已知 miRNA 尚未显示具有 pri-miRNA 基序或完全鉴定的 pri-miRNA 序列 ( Auyeung et al., 2013）。研究人员还通过设计前体链上游和下游 100 bp 的引物来靶向 pri-miRNA 链（Conrad 等人，2020），以定义 pri-miRNA 序列本身（Wang 等人，2018a）。然而，这种方法限制了识别调控元件的潜力，包括 miRNA 结合位点，这些位点可能位于所选引物指定的区域之外。

miRNAseq 和 RNAseq 文库的生物信息学分析对于发现 miRNA:miRNA 相互作用及其细胞影响非常宝贵。然而，研究人员应该仔细考虑当前方法的局限性和缺点，并通过生命系统的实验来验证发现。

本综述中讨论的 miRNA:miRNA 相互作用的范围扩展到特定癌症环境的背景。尽管许多癌症类型表现出相似的特征，但 miRNA 的表达、miRNA:miRNA 调节途径和靶点抑制程度是特定于起源细胞类型的（Matsuyama 和 Suzuki，2019 年；Shao 等人，2019 年）。因此，在调查 miRNA:miRNA 相互作用和广泛应用这些发现时必须谨慎，因为由 miRNA 与 miRNA 关联介导的特定调节途径在其他细胞类型中可能不同。

目前研究 miRNA:miRNA 相互作用的策略通常涉及转染 miRNA 模拟物或反义抑制剂。任何基于这些方法的结论都需要谨慎，因为引入外源性 miRNA 会固有地改变内源性 miRNA 和 mRNA 表达（Khan et al., 2009）。应与加扰 miRNA 对照进行比较，以识别生物学相关的变化。另一种方法可能是在初级或前体转录阶段调节 miRNA，以避免 AGO2 饱和。另一种可能性是使用适体或更长的反义链来隔离内源性 miRNA。未来的实验应该考虑如何确定 miRNA:miRNA 相互作用及其对细胞功能的影响，而不会彻底改变内源性 miRNA 和 mRNA 的微妙平衡。

目前，很少有 miRNA 研究考虑 miRNA 对整体 miRNA 表达的更广泛影响。miRNA 领域：miRNA 相互作用通常集中在一对特定的 miRNA 或一小部分，而不是 miRNA 环境中发生的变化。由 miRNA:miRNA 相互作用导致的 miRNA 和 mRNA 改变已被证明会影响细胞生长和转移（Borzi 等人，2017；Wang 等人，2018a）。通过考虑一个或几个 miRNA:miRNA 相互作用，我们忽略了 miRNA 介导的调节固有的系统级影响。

总之，miRNA:miRNA 相互作用，尤其是那些包含 miRNA 和 mRNA 环境的相互作用，需要重新评估，而这种增加的调节途径可能支持或推动对疾病机制的更好理解。有趣的是，细胞核中 miRNA 的存在及其靶向 pri-miRNA 的潜力表明它们在基因调控中的作用可能比靶向 mRNA 的 3'UTR 的经典模型更广泛。我们不能再持有一个简单的 miRNA 可以调节多个靶点的概念。相反，这必须扩展以纳入 miRNA 可以相互调节的想法。由于 miRNA 是有效的调节剂，并且已被证明可以驱动致癌途径，因此 miRNA:miRNA 相互作用的影响可能是深远的。向前进，