【佳学基因检测】第三代测序是高通量测序吗？

1.PacBio SMRT单分子测序技术

Pacific Biosciences于2004年成立，2010年纳斯达克上市，2011年PacBioRS发布。

以PacBio测序为代表的第三代基因测序技术逐渐应用到多个科研领域。该平台利于单分子实时测序技术，又称作SMRT（Single Molecule Real-Time）测序，基于纳米小孔的单分子读取技术，无需扩增即可快速完成序列读取。

建库

因为测序读长很长，因此可以制备大片段（3-10kb）文库；不同于其他二代测序文库，该文库两端分别连接环状单链，单链两端又与双链正负链连接，得到类似哑铃的结构，称为SMRT Bell。

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测序

SMRT Cell芯片含有数百万个纳米级的零模波导孔（zero-mode wave guides, ZMWs），ZMW是一个直径只有10~50nm的孔，引物在模板的单链环部位退火后，这个双链部位就可以结合到已固定在ZWM底部的聚合酶上。

每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，4种dNTP带有不同的荧光标记。当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。

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只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到。当DNA合成进行时，下一个碱基进行延伸，上一个dNTP上的荧光基团就会被切除，保证了检测的连续性。

不同的碱基会发出不同的光，此时根据光的波长及峰值便可判断碱基类型。

2.纳米孔测序技术

2005年，牛津纳米孔科技有限公司(Oxford Nanopore Technologies)成立，致力于纳米孔测序技术的商业转化。2014年Nano space单分子测序技术发布。

牛津纳米孔公司开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号。

纳米孔测序技术的核心是一种整合了多个跨膜通道蛋白（即纳米孔蛋白）的多聚物膜。通过在膜两侧施加电压从而产生稳定的穿过纳米孔的电流。当有其他物体穿过纳米孔时，会影响电流的大小，从而产生可识别的电信号的变化。

测序时，DNA双链在马达蛋白的牵引下解螺旋为单链DNA，并穿过纳米孔蛋白（也叫Reader蛋白）。由于ATCG四种碱基结构和大小的差异，会使电流产生特征性离子电流变化，通过识别这种电信号的变化，从而达到读取碱基序列的目的。

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不同型号的纳米孔测序仪原理非常一致，其核心均为纳米孔测序芯片。常规的纳米孔测序芯片整合512个测序通道，每个测序通道包含四个纳米孔，官方数据显示单张芯片不间断测序48h，可产生20-30G的数据量。

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二代测序的出现极大地解决了通量问题，在大幅提高测序速度和准确性的同时大大降低了测序成本，但阅读长度相对较短。而以单分子测序为主要特征的三代测序，正朝着单分子、长读长、低成本、小型化的方向发展，实现了测序领域的又一次变革。