【佳学基因检测】血液系统疾病的基因矫正治疗

遗传病、罕见病基因检测导读：

佳学基因在掌握了造血干细胞（HSCs）的分离和扩增特性以后，可以对免疫系统及造血系统进行修改和重建，从而在细胞和基因治疗发展的前沿开展研究和产业化工作。基因组编辑技术的最新进展，特别是聚集的规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）和CRISPR/Cas衍生的编辑系统，改变了基因治疗的格局。这一工具系统应用的灵活性及其在基因的失活、矫正及插入方面的应用拓宽了可以进行基因治疗的靶标，使得我们可以通移植经过修改的造血干细胞来开发一系列罕见疾病的治疗方案。基因矫正技术和特色在于更高的编辑效率和更准确的基因修改位置，治疗方案的可耐受性更好，更容易运输进行异地治疗及更低的治疗费用。为了得到患者、监管机构及社会大众对这一先进治疗方案的理解，佳学基因综述了造血干细胞的基因编辑在遗传病治疗方面的进展。介绍了这一技术的临床前实验及临床研究中最有意义的发现。本文通过介绍以造血干细胞为基础的基因治疗，讨论了基因组编辑在临床转化中所遇到的困难。同时也指出基因编辑技术的进展将促进普通疾病及其以外更多疾病的应用。

血液及免疫系统疾病的基因解码

血红蛋白病、原发性免疫缺陷（PIDs）和先天性血细胞减少症都有一个主要的共同点：它们是由造血干细胞（HSC）内的遗传序列异常引起的遗传性血液病，影响一个或多种血液细胞的产生和功能。[1] 原则上，这些疾病中的每一种都可以通过用基因正常的造血干细胞替换有问题的突变造血干细胞来治愈，然后这些造血干细胞又可以重建一个全新的功能性血液淋巴系统。自1968年Good及其同事首次成功将HSC移植到患有X连锁严重联合免疫缺陷（X-SCID）的儿童身上以来，异基因HSC移植（HSCT）已成为此类遗传性疾病患者唯一的治疗选择[2]。然而，迄今为止，异基因造血干细胞移植的广泛应用受到需要合适的人类白细胞抗原（HLA）相容供体的要求的限制以及移植前需要采用细致的清髓预处理方案的限制，这可能导致不孕、继发性恶性肿瘤和器官损伤[3]。移植过程中频繁的短期和长期副作用，如免疫抑制方案引起的感染、移植物排斥反应和移植物抗宿主病，进一步阻碍了HSCT的发展。在目前的实践中，只有50%的患者有合适的HLA相合供体，可以进行HSCT，并且移植死亡率高达20%[4,5,6]。

由于这些限制，自体HSC基因治疗的想法，即患者自身的突变HSC基因经过基因改造，得到了发展，因为它为大量血液病提供了一种潜在的终生治疗，而无需HLA匹配的供体，不会出现相关的免疫并发症。此外，在自体环境中，移植前降低了强度的治疗可以使血液淋巴细胞系统更快地重建，并有助于患者获得列好的生存结果[7,8]。最初，自体HSC基因治疗主要通过整合病毒或非病毒基因传递系统，在HSCs中通过添加致病基因的一个具有正常功能的基因拷贝来实现[9]。早期临床试验证明，病毒介导的永久基因转移治疗多种危及生命或孤儿血液疾病，不仅包括先天性造血障碍：镰状细胞病（SCD）和β地中海贫血[10,11,12,13]；Fanconi贫血（FA）[14]；免疫机能缺陷症，Wiskott–Aldrich综合征（WAS）[15,16]和X-SCID[17]；也包括代谢储存障碍，如X-连锁肾上腺髓白质营养不良（X-ALD）[18,19]和变色性白质营养不良（MLD）[20]。然而，仍然存在若干困难。首先，最有效的病毒传递系统的包装能力限制了治疗性转基因，从而限制了通过基因添加方法可以治疗的疾病。其次，对于功能获得性有害突变，单纯添加蛋白质编码基因不能实现功能矫正。第三，永久基因加入方法的一个主要缺点是治疗基因整合位点不可预测，因此，插入突变、癌基因反式激活和转基因、邻近基因异常表达的是这一方法的内在缺点[21,22,23,24,25]。相反，尽管进行了大量的研究工作，但通过应用概念上更安全、非整合性载体的方法进行疾病校正仍然是短暂和低效的[26,27]。因此，综合起来，基因添加具有固有的安全性和效率缺陷，这就使得寻找替代基因治疗方法成为合情合理的事情。

可编程核酸酶技术的最新进展，包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活物样效应器核酸酶（TALENs）、聚集的规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）以及最近基于CRISPR/Cas的表观遗传学，碱基及引物编辑系统从策略上改变了基因治疗方法。与非靶向基因添加载体相比，可编程核酸酶及其衍生物具有识别和结合特定基因组位点的能力，从设计理念上具有安全优势，从而能够纠正致病突变或位点特异性破坏和整合事件，而没有内在的插入突变风险[28]。对于许多遗传性疾病来说，受影响基因的生理性和高水平表达是必不可少的，这很容易通过基因编辑工具获得，而且它们有能力来恢复正常的基因组序列，而象基因添加方法那样需要减少编码或调控序列。作为一种更安全，尽管目前效率较低的非靶向基因添加的替代方法，基因编辑工具还允许在所谓的“安全港”基因座上有针对性地插入整个表达盒，或者在缺陷基因位点精确添加或替换功能性无启动子序列，以便在内源性控制元件下进行控制[29,30]。与非靶向插入相比，后一种方法还可以处理毒性获得性功能突变，而与突变特异性精确修复相比，前一种方法还可以处理大的缺失或多个功能缺失突变。在过去的十年中，大量的临床前研究为基因编辑自体造血干细胞的治疗潜力提供了概念证明，最近的基因编辑治疗血红蛋白病的临床试验结果证明了这一点[31]。因此，更多可通过自体基因修饰的造血干细胞（见图1）靶向的遗传性疾病或疾病倾向可能很快进入临床试验及以后的开发阶段。尽管正在进行的研究在解决问题的同时仍然揭示了基因编辑的许多潜在陷阱，尽管在技术领域和监管轨道上仍然存在许多障碍，但在过去十年中，基因编辑技术的发展取得了惊人的进展。在此，我们简要回顾主要基因组编辑技术（ZFN、TALENs、CRISPR/Cas9）的主要特点，并提供了当前HSC基因编辑治疗方法的最新概况，强调了主要成就和仍然存在的挑战。此外，针对相应的临床前和临床研究结果，我们总结了遗传性血液病突变特异性基因组编辑领域的一些突破。最后，我们批判性地讨论了如何解决当前的局限性和关注点，以促进这些疗法在临床上的应用。

通过编辑HSC可能治愈的典型遗传性疾病一览图。与每种疾病相关的基因在括号中标明。给出的细胞类型表明蛋白质表达或表型校正最明显的地方。请注意，联合免疫缺陷影响B细胞功能，即使在表现为B+表型。单核细胞和巨噬细胞（MΦ）也可能作用于造血系统外的细胞并用于疾病纠正（未显示）。红细胞（RB)，自然杀伤细胞(NK)。

造血干细胞基因编辑框架

基因编辑工具概述

早期对靶向基因编辑的尝试依赖于将带有同源臂的供体质粒传递到靶序列，并依赖细胞同源重组机制的自发作用来促进编辑或定点整合。在开发合适的工具来增加靶位点的重组事件之前，这种方法的低效率和校正频率不适合治疗应用。随着双链断裂（DSBs）在受影响的位点刺激内源性DNA修复机制的作用的发现，许多可编程核酸酶能够在不同的位点诱导DSBs，用于基因研究和基因治疗。迄今为止最流行的基于DSB的编辑平台包括ZFN、TALENs和RNA引导的CRISPR/Cas核酸酶。核酸酶诱导的DNA断裂主要通过两种内源性途径修复，（i）易出错的非同源末端连接（NHEJ）途径，该途径在整个细胞周期中通过连接DNA末端来纠正DSB，但偶尔会导致DSB位点的插入或缺失（INDEL），或者（ii）高保真同源定向修复（HDR）途径，该途径仅限于细胞周期的G2/S期，并且需要同源序列的存在作为修复DSB的模板[32]。通常，NHEJ被用于基因的破坏、敲除、反转或标记，而HDR被用于在特定基因组位点精确引入所需的序列改变（缺失、替换或插入）。

每个核酸酶平台基于一个可定制的序列特异性DNA结合域和一个非特异性DNA切割域。对于ZNF和TALEN，DNA分别与同名的锌指和Tal效应器核酸酶域结合；对于CRISRP/Cas，DNA与单链导向RNA结合；对于ZFNs和TALENs，DNA由二聚体FokI核酸酶切割；对于CRISPR/Cas，DNA与由单体Cas切割。表1概述了研究最广泛的基因编辑技术的主要特点。ZF结构域首先在非洲爪蟾的转录因子IIIa而TALE结构域首先在黄单胞菌的中发现，每个结构域分别识别3个和1个碱基对。这些共价连接到FokI核酸内切酶的识别域的模块化串联允许两个ZFN或TALEN单体结合到预定切割位点任一侧的对侧DNA链上，这导致FokI的活性二聚体形式的靶特异性切割。另一方面，虽然ZFN和TALEN的设计比旧的编辑平台更容易[33]，但由于需要复杂的蛋白质工程和克隆操作方案[34,35]，ZFN和TALEN的生成过程都很费劲，这使得为新靶点设计有效的核酸酶成为基因编辑领域的瓶颈。2012年，从抗病毒细菌免疫系统中衍生出RNA引导、序列特异性CRISPR/Cas9核酸酶系统，可以消除这些限制，从而改变编辑领域。在其工程形式中，CRISPR/Cas包含Cas9核酸内切酶和携带20个核苷酸靶识别序列的单一导向RNA链（sgRNA）。它的唯局限是是额外需要一个短的（通常是3-5个核苷酸）的原始间隔序列领近模块，由使用的Cas分子决定。CRISPR/Cas平台提供了一个简单、通用、廉价和可预测的基因编辑平台[36,37]。该系统的两个主要缺点是（i）依赖于裂解近端PAM位点，这已通过选择或设计具有改变或放松序列要求的Cas分子来解决[29,38,39]，以及（ii）单体分子技术相对较低的靶向特异性和保真度，以及相对较高的脱靶活性，其最常见的解决方法是使用nickase-Cas分子的二聚体，通过使用或设计（高保真度）Cas分子，减少非特异性DNA相互作用，并通过更瞬时的CRISPR/Cas传递[40]。在临床应用方面，特异性增强策略随后辅以候选核酸酶的脱靶评估，通过饱和评估潜在的脱靶位点或全基因组方法，可以为下游应用选择最高特异性工具。

然而，即使是对于高度特异性设计的核酸酶，对精密修复的有效性和应用的一般安全性仍然存在更多的顾虑。最近在提高HDR的效率方面取得了重大进展，基于DSB的精确编辑即使在原始HSC[41,42,43,44,45]，临床应用HDR的效率也有所提高，但仍有人担心DSB的使用，因为它可能会选择凋亡缺陷细胞[41,46，47]或引发意外重组事件[48,49]。基于DSB的精密修复的效率考虑和对临床应用安全性的严重关注，催生了对HDR和独立于DSB的精密编辑工具的探索。其成果是工程化学碱基编辑器的使用，当仅有缺刻酶的Cas9融合到胞苷脱氨酶结构域时，允许永久C>T/G>碱基置换，后来变成腺苷脱氨酶，可以进行反向A>G/T>C基变化[50,51]。碱基编辑的特点是，高效，插入缺失形成最小化以及DSB诱导最小化，但也有可能对近端，周围碱基的意外修饰，以及无法创建精确的缺失插入突变或者是嘌呤到嘧啶、嘧啶到嘌呤的颠换。在克服这些缺点的另一个里程碑式努力中，将仅有nickase的Cas9与逆转录酶域和多功能的引物基本编辑导向RNA（PEGNA）结合起来，后者进行目标识别，同时作为反向转录的引物和模板。虽然目前的效率不如碱基编辑，但所产生的引物编辑技术比化学修改更为通用更为精确。不仅可以进行所有 的12个可能的碱基对碱基的转换之外，还允许创建小的精确的插入缺失突变[52]。除了碱基和引物编辑工具外，还通过将催化活性不活跃的核酸酶如死亡Cas9（dCas9）模块化融合，建立了一系列表观基因组编辑器，这些酶域包括表观遗传修饰物，如甲基酶或转录因子的转录激活结构。多种表观遗传修饰的组合甚至可以实现几乎永久的可逆转录变化，可以在经历数百个有丝分裂而保持稳定[53,54]。

迄今为止，基于DSB和不依赖DSB的编辑技术都已被证明能够纠正包括HSC在内的许多细胞类型的致病基因突变，目前需要克服平台在安全性和有效性方面的特定不足。

2.2. HSC编辑临床应用的关键因素

以造血干细胞为编辑底物，可编程核酸酶的主要类别已被用作治疗遗传性血液病的治疗工具（图2）。所采用的策略依据所针对的疾病和所选择的递关方式可大致分为体外或体内基因编辑方法。

通用基因编辑平台的结构、功能及基于HSC的应用。ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9是嵌合蛋白质，其包含可定制的序列特异性DNA结合域（例如，锌指ZF、转录激活物样效应蛋白TALEs或单导向RNA sgRNA）和介导DNA切割的非特异性核酸酶（例如：在ZFNs和TALENs中的FokI核酸酶和在CRISPR/Cas9中的Cas9）。ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9产生的DNA双链断裂主要通过两种内源性途径修复：（1）易出错的非同源末端连接（NHEJ），它发生在整个细胞周期中，通过连接DNA末端来纠正断裂；（2）通过精确的同源定向修复（HDR），在提供的供体模板存在下，例如，作为合成单链寡脱氧核糖核苷酸（ssODNs）、插入失活慢病毒载体（IDLV）或腺相关病毒6载体（AAV6）组分。碱基编辑器是由突变的核酸酶组成的嵌合蛋白质，如Cas9-nickase（nCas9），一个催化结构域，能够使胞苷或腺嘌呤碱基脱氨以诱导碱基置换，和一个尿嘧啶糖苷酶抑制剂以防止碱基置换过程中的碱基切除修复。引物编辑器是一种嵌合蛋白，利用扩展的gRNA，称为引物编辑导向RNA（pegRNA）和融合到逆转录酶的nCas9，后者切割DNA，使侧翼gRNA的pegRNA结合成为所需序列变化的pegRNA定向逆转录的引物。

历史上，影响造血细胞系的遗传性血液疾病，如血红蛋白病、PIDs和储存障碍，已通过体外处理HSC得到解决。而影响细胞外血蛋白的遗传性血液疾病，如凝血因子缺乏症和血友病，通过向肝细胞进行体内体内交付来解决。直到最近，我们还看到了以HSC为基础的体内基因治疗遗传性血液病的努力，以减少治疗相关的风险和死亡。图3展示了体内和体外HSC基因编辑的关键步骤。在分离和操作HSCs方面取得的进展与成熟的HSCT方案相结合，有利于HSCs的体外修饰，这种修饰已经在临床上应用于多种遗传疾病。尽管有这些令人兴奋的进展，但为了使基于基因编辑的自体造血干细胞的治疗充分发挥其潜力，仍然存在需要解决的主要障碍。相关因素包括：（i）来源：长期再生HSC的来源和选择；（ii）培养：为扩增和编辑提供环境，同时保持HSC的‘干性’和高植入潜力，（iii）递送：将编辑成分应用于体外或体内靶细胞/组织，以及（iv）案全性：避免、识别和消除重组事件和非靶细胞进入和编辑事件，以及预防其他治疗相关的并发症。
图3：

体外与体内HSC基因编辑。所示的体外编辑步骤广泛应用于体内动物模型的基因编辑，现在也应用于基因编辑的临床试验。基因添加疗法的研究结果表明，基因编辑也可能受益于通过提供抗体-药物结合物来选择性去除HSC[55]，对于适当的疾病，如FA，也可能受益于无预处理植入校正细胞[14]。显示的体内编辑步骤部分是针对HSC靶向基因添加方法的外推[56,57,58]，部分是基于基因编辑成分和mRNAs传递的最新进展和理念[59,60,61,62]。

2.2.1. HSC的来源和分离

造血干细胞占成人骨髓细胞的比例不到0.1%，是一种罕见而脆弱的细胞群，通常存在于与细胞外基质、成骨细胞和基质细胞相连的特殊微环境中，这些微环境在很大程度上决定了它们的静息状态、自我更新或分化行为。HSC可以通过全身麻醉或局部麻醉下的多次骨髓穿刺来收集，或者在HSC从骨髓基质强制分离（动员）到外周血后通过白细胞清除来实现。目前，经过FDA批准的临床上可以使用的动员剂有三种：造血生长因子、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）以及小型药物趋化因子类似物普列沙福。一系列评估不同动员剂在基于HSC的基因治疗中的安全性和有效性的临床试验表明，G-CSF和普列沙福的联合应用可以增强HSC的动员和持续的体内再增殖潜能[63,64,65,66]。或者，对于少数（5–10%）对一线方案反应不佳的病例（5–10%），疗效较差的GM-CSF可用作补救策略[67]。值得注意的是，收集用于临床应用的造血干细胞的一个主要问题是某些疾病（如FA和其他骨髓衰竭综合征）可获得的细胞数量，其中造血干细胞的数量/质量以及骨髓的成分显著受损。为此，诱导多能干细胞（iPSC）技术的发展[68]提供了另外一种患者来源细胞，许多研究小组将其作为基因靶向的可再生细胞来源加以利用。IPSC在生成HSC的潜在应用在此不再赘述，但围绕这一概念的广泛希望和关注最近已在其他地方进行了详细论述[69]。

以表面标记CD34、CD133、CD90、CD38、CD45RA为基础的原始、长期再生造血干细胞（LTR-HSC）的免疫表型特征已取得进展，因此在人类和非人灵长类动物中，它们的定义不同，例如CD34+CD38−, CD34+CD90+、CD34+CD90+CD133+或CD34+CD90+CD45RA− 细胞[41,42,43,44,45,70,71]。然而，由于CD34+细胞在治疗性HSC移植中的长期成功经验，祖细胞在移植后早期骨髓重建中的支持作用，具有高度特异性选择方案的LTR-hsc的总产量显著降低，临床方案很大程度上依赖于CD34+的单标记免疫磁性选择[45,72]。唉，CD34+细胞群本身在很大程度上是异质性的，只有一小部分细胞（1–3%）代表LTR HSC[16,73,74]，它们似乎位于CD34+CD38−细胞群中。CD34+CD380–6%的人群几乎代表了所有短期和LTR-HSC潜能的总和[75]。然而，CD34-细胞对LTR-HSC池也有重要贡献[76]。因此，对于所有LTR-hsc的明确的阳性/阴性选择方案，如全面大规模细胞分离所需，仍然是难以捉摸的，但具有关键的实际意义。高嵌合体和移植后快速重建依赖于高细胞产量，而特别是对于HSC的基因治疗应用，利用更纯的细胞群将有助于降低成本并使治疗更为广泛，因为载体需求与暴露于载体的细胞数量大致成比例。在这种情况下，许多临床试验证明了CD34+CD90+细胞的成功移植[70,71]，而一些研究表明，对于慢病毒基因的添加，分选高纯度的CD34+CD38− 或者CD34+CD90+HSC可以减少培养体积，减少载体需求，显著提高转化效率[75,77,78]。在临床应用方面，开发基于免疫磁珠富集的良好生产规范（GMP）分级平台，允许CD34+CD38-的富集和细胞转导，而在转导后加入祖细胞CD34+CD38+细胞可以加速髓系重建[75]。优化和采用这一或其他LTR-HSC选择性系统以获得特异而全面的LTR-HSC，降低载体成本，减少处理和培养时间，将极大地促进基于HSC的基因编辑的临床应用。

2.2.2. 真LTR-HSCs的体外扩增与编辑

HSCs的有效遗传修饰需要HSCs的体外培养和扩增。然而，从天然支持性微环境中移除对脆弱的造血干细胞有负面影响。此外，在收集和免疫磁性富集后，来自骨髓或动员的外周血的大多数CD34+细胞处于静止状态（细胞周期的G0/G1期）。这对依赖于修饰后细胞的扩增或依赖于细胞周期的基因编辑策略提出了造成了的挑战，例如HDR是与依赖与NHE相反的S/G2限制性的策略[79]。CD34+HSC的预激活促进了细胞退出静止状态以便进行有效的基因修饰，而增加的刺激也与诱导分化和HSC长期植入能力的损伤有关[77,80]，这将对临床应用产生可怕的后果。通过在免疫缺陷小鼠中植入修饰细胞的两项示范性研究证明了这种植入和长期再植入能力的降低，特别是基于HDR的修复，在小鼠骨髓中人类细胞的长期（16周）修饰率与移植细胞中的初始修饰率进行比较，NHEJ介导的编辑（55%↴46%, 19.8%↴3.3%比HDR介导的编辑（11.8%↴2.3%, 17.3%↴0.9%)更接近 [81,82]. 目前，基于无血清培养基（通常补充有重组造血生长因子和细胞因子，如干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、血小板生成素、白细胞介素-3和白细胞介素-6）优化的HSC体外培养和刺激条件，使造血干细胞增殖旺盛，但也逐渐分化。为了克服这一局限性，已投入大量精力建立新的培养和输送方案，以提高HDR率，促进HSC的体外扩增，同时保留其“干细胞”特性，如文献所述，最近通过抑制p53结合蛋白1增加了这一点[60,83，84,85]. 在过去几年中，已经研究了通过同步S/G2期细胞、通过诱导HDR成分或通过药理或遗传抑制NHEJ成分来改善HDR介导的基因编辑的策略[85,86,87,88,89]，包括不同类型HDR供体的适用性（见下文第2.2.3节）。同时，高通量筛选研究发现了一些小分子，如前列腺素E2（PGE2）、茎叶皂甙元1（SR1）和嘧啶吲哚衍生物UM171，它们能够提高HSC的转导效率，促进HSC在体外的扩增[77,90,91,92]。然而，这些化合物对造血干细胞长期再生能力和多向分化潜能的影响仍有待进一步研究。
 

2.2.3. 递送——到达目标细胞和部位

基因编辑工具（包括编辑器和任何外源性同源供体修复模板）高效、无毒地导入HSC是基因编辑HSC临床应用的长期挑战之一。

尽管编辑器可以以多种不同的形式进行递送，但基于HDR的方法HSC基因编辑依赖于供体DNA修复模板在编辑过程中的共同传递和存在，如通常化学修饰的ssODN、单链DNA（ssDNA）病毒基因组，或者用于长靶向插入的双链DNA分子。不同的供体利用不同的修复途径，具有不同的毒性水平和编辑精度，由于原始HSC对该操作过程的顽固性和敏感性，优化修复途径尤其对临床应用提出了挑战[42,93,94]。

多年来，开发了多种非病毒和非整合的病毒传递系统，用于体内或体外核酸酶的传递，包括质粒DNA、体外转录RNA、TALEN/ZFN蛋白或CRISPR/Cas核糖核蛋白复合物（RNP）等非病毒载体，整合酶缺陷型LV（IDLV）、腺病毒（AdV）和腺病毒相关病毒（AAV）作为病毒载体。每种系统都有各自的优缺点。利用携带核酸酶和供体模板的质粒DNA进行电穿孔是编辑HSCs最廉价、应用最广泛的方法。然而，HSC的毒性、质粒细菌DNA的骨架以及由于核酸酶表达盒可能随机整合到宿主基因组中而导致的遗传毒性的固有风险的担忧，使其仅限于用于原理性研究[95,96]。考虑到基因编辑系统在靶细胞内的持续时间和浓度是决定靶向和非靶向DNA切割的关键因素，通常主要目标是采用“命中-逃逸”方法，包括在靶细胞内瞬间高表达核酸酶。为此，体外转录的mRNA或编码核酸酶的gRNA/mRNA和供体模板的核转染或脂质体转染已成为HSC基因编辑的首选递送形式，多项研究表明，此方法具有高转染效率和最低细胞毒性[97,98,99]。体外转录mRNA的瞬时和强大的细胞质内表达将潜在的非靶向插入或突变风险降至最低，同时一些研究进一步研究了（下调）精确编辑的编辑时间窗口的方法[100,101,102]。相反，对于某些应用，mRNA的短半衰期可能是一个限制因素[103]。因此，一些研究小组致力于修改体外转录的mRNA的结构元件，特别是通过加入抗逆转帽类似物、聚（a）尾和含有调控元件的5′和3′UTRs来增强细胞内稳定性和翻译效率[104]。最近，Wesselhoeft及其同事报告说，环状RNA提高了RNA的稳定性，并与细胞内蛋白质产量和稳定性的提高有关[105]。就像体外转录的TALEN和ZFN的mRNA或CRISPR/Cas的mRNA/gRNA一样，预组装的CRISPR/Cas核糖核蛋白（RNP）复合物是HSC基因编辑的高效载体，允许在体外更可控和瞬时地传递核酸酶活性[106107108]。因此RNP电穿孔发展成为HSC体外修饰的一种选择方法时，HSC的体内递送作为一个新兴的关注领域在使用纯化的核酸酶时提出了一些技术挑战。Cas9蛋白的大尺寸和正电荷阻碍了其在体内的细胞内传递，而Cas9蛋白在体内的暴露又可能引起细胞和体液免疫反应。事实上，鉴于CRISPR/Cas的微生物来源，在79%和65%的人类血清中分别检测到来自金黄色葡萄球菌（SaCas9）和化脓性链球菌（SpCas9）的Cas9抗体并不奇怪[109]，这对编辑效率的影响需要降低到最低。为此，减少核酸酶降解和宿主潜在免疫反应的脂质或金纳米颗粒已被用于体内基因编辑，尽管在造血干细胞中实现的基因编辑率不足以治疗大多数造血疾病[110111]。此外，许多非整合病毒载体，如IDLVs和AAVs等，对hsc具有高度的趋化性，已被用于基因编辑成分的传递。非整合型AAV病毒载体（尤其是rAAV6）由于其在非分裂细胞（如HSCs）中的高转导率和非致病性行为而成为一种很有前途的核酸酶传递系统，使其成为体内和潜在治疗应用的理想载体。然而，它有限的包装容量低于4.8kb，这使得它不适合像TALENs和许多Cas9变体这样的大型核酸酶。为了解决这一局限性，Bak等人最近开发了一种双AAV6供体载体系统（具有6.5 kb的包装容量），该系统能够有效地靶向T细胞和造血干细胞而毒性很低[112113]。IDLVs甚至整合LVs，由于其大于10kb的载量，已被广泛用于核酸酶和供体DNA模板的传递，用于筛选文库等研究性应用，IDLVs也被提出用于临床应用。然而，AAV-和IDLV-衍生的单链DNA在靶组织中保留很长时间[114115]，因此存在持续基因组修饰和外源DNA错误整合的风险。

2.2.4. 安全性：避免靶细胞和部位失去目标及临床实验中的其他未知因素

基因编辑产品的质量可以受到上述三个因素中的任何一个，即来源、培养和交付的次优选择的限制。需要进行大规模的临床前研究，以确定确保每种疾病的基因编辑产品的治疗效益所需的长期安全性、持续性和最佳校正水平，同时将细胞毒性和潜在的靶外活性保持在最低水平。

与传统的基因治疗方法相比，基因编辑平台消除了病毒载体近随机整合的需要，从而最小化插入性遗传毒性的风险。然而，监测可编程核酸酶的活性和特异性仍然是一个挑战。基因编辑的HSC治疗潜力最大的担心之一是在与预定目标具有实质序列相似性的位点引入不需要的非目标基因组修饰[48]。基于DSB甚至HDR介导的基因编辑固有的另一个担心是，由于意外地使用替代修复途径（例如基于NHEJ的修复）而引入在靶标上进行的插入缺失或重组事件，这可能导致潜在的插入缺失，或者在某些情况下可能引发潜在的致癌易位突变。已观察到四种主要可编程核酸酶中的每一种都存在非目标活性[116171118119]。为了评估和帮助最小化目标外活动和相关风险，开发了越来越多的分析方法，以确定目标外事件的分布和频率，包括基于序列同源性和计算算法的硅工具方法、离体方法（CIRCLE-Seq，Digenome-seq和SITE-seq）和基于细胞的分析方法（GUIDE-seq、BLESS/Blis和HTGTS）[120]。GUIDE-seq和Digenome-seq被认为是迄今为止最敏感的全基因组方法；然而，没有一种方法被证明适合于临床试验[121]。染色体重排评估方法目前才出现[48,49]，CAST-Seq甚至允许定量评估，尽管仅限于预测的on-to-off靶位点之间的重组事件[122]。 

碱基和引物编辑作为不依赖于DSB的编辑策略有助于降低甚至消除DSB介导的遗传毒性事件的内在风险。此外，减少编辑分子脱靶活性的策略有助于减少因疏忽而产生的插入缺失和重组事件，这也适用于DSB依赖的编辑。发表了大量限制脱靶的策略，除了对编辑工具的有限接触外，还包括但不限于在ZFN和TALEN中使用专性异二聚体FokI，使用nickase-Cas9二聚体分子，建立更严格的PAM序列，高保真Cas版本中非特异性DNA相互作用的去除，CRISPR/Cas sgRNAs的截断、延伸或泡状发夹修饰[40，123，124]

尽管有大量的研究小组正在致力于上述四个领域的进一步技术开发，但HSC编辑的临床前和临床应用进展迅速。这尤其得益于临床前和临床试验的经验，这些经验来自于有关HSC来源和培养的基因添加方法，部分基于有效的体外RNP传递，结合饱和脱靶分析，以应对编辑最紧迫的安全问题。