【佳学基因检测】基因检测技术之PCR和QPCR

什么是聚合酶链式反应 (PCR)？PCR 需要 DNA、核苷酸、引物和 Taq 聚合酶来生成无限量的 DNA。在 PCR 中，通过在琼脂糖凝胶上运行或在 qPCR 中用相机检测，可以看到该目标 DNA。使用不同颜色标记的 qPCR 探针可以扩增每个试管中的许多目标。PCR 和 qPCR 用于疾病诊断和医学研究。观看 YouTube 视频或继续阅读以下内容以了解更多信息。

什么是聚合酶链式反应 (PCR)？

美国科学家 Kary Mullis 于 1983 年发明了 PCR。他的想法是使用两个引物，核苷酸和 DNA 聚合酶，来制作无限量的 DNA 副本。

聚合酶链式反应 (PCR)。图片显示 2 个引物、核苷酸和 DNA 聚合酶可以制作无限量的 DNA 副本。有一个 ClevaLab 徽标。

引物是与目标 DNA 配对的 20 bp DNA 片段。引物的 DNA 序列非常特殊，以至于从 22,000 个基因的背景中，它们可以扩增一个基因。DNA 以两条链的形式存在。因此，要使引物接触 DNA，首先需要通过加热到 95 摄氏度来分离链。当混合物冷却到 60 度时，引物会与 DNA 的相反链结合。结合使它们位于目标区域的两侧。DNA 聚合酶只能沿一个方向复制 DNA。因此，链以相反的方向形成，从而产生重叠的副本。DNA 聚合酶对 DNA 的这种复制将使 DNA 的数量翻倍。反应再次加热到 95 度以分离 DNA。冷却后，引物也会与新的 DNA 结合，DNA 聚合酶会进行另一次复制。对于每个 PCR 循环，DNA 的数量都会翻倍。因此，两个 DNA 副本可以在 20 个 PCR 循环中变成 200 万个副本。

PCR 方法：引物和 DNA 聚合酶结合并复制目标 DNA。有 2 条 DNA 链和 2 个 DNA 聚合酶复制 DNA 的目标区域。这是一张插图，左下角有一个 ClevaLab 徽标。0 个循环 = 2 个 DNA 副本。

PCR 方法：经过一个循环，DNA 加倍。此图中显示了 4 条 DNA 链。每条链编号为 1、2、3 和 4。左下角有一个 ClevaLab 徽标。

PCR 方法：加热至 95 摄氏度会分离 DNA 链。有 4 个 DNA 副本彼此分离。这是一张插图。左下角有一个 ClevaLab 徽标。

PCR 方法：经过 2 个循环，DNA 再次加倍。经过 2 个循环，有 8 个 DNA 副本。插图显示 DNA 聚合酶复制 DNA 链，所有 8 条链都标有数字 1 到 10。左下角有一个 ClevaLab 日志。

引物的侧翼位置限制了扩增 DNA 的长度。扩增结束时，可以在凝胶上看到该 DNA，它将是一个离散的条带。

PCR 方法：在凝胶上电泳时，扩增的 DNA 显示为一条条带。在此插图中，扩增的 DNA 被加载到琼脂糖凝胶上的一条泳道中。运行时它形成一条带。左下角有一个 ClevaLab 徽标。

Taq 聚合酶在 PCR 中的用途：

将混合物加热到 95 度会破坏 DNA 聚合酶。因此，每次加热循环后都会添加新鲜的 DNA 聚合酶。这种手动添加非常耗时且容易出错。但在 1988 年，来自 Cetus Corporation 的 Randall Saiki 使用了一种不同的 DNA 聚合酶进行 PCR。一种来自水生栖热菌 (Taq)。水生栖热菌是一种生活在温泉中的细菌。因此，在 95 度加热步骤中，它不会被破坏。使用 Taq 聚合酶意味着 PCR 可以持续到最后，而无需添加更多聚合酶。Cetus 还创建了一种自动化 PCR 的仪器。第一台热循环仪 TC1 使用金属加热块和内置计算机自动加热和冷却。这种自动化使 PCR 过程变得容易得多。

矢量图形。来自水生栖热菌 (Taq) 的 DNA 聚合酶可以承受 95 摄氏度的加热。图中显示了细菌在温泉中的位置。角落里有一个 ClevaLab 徽标。

RNA 如何在 PCR 中使用？

Taq 聚合酶只能复制 DNA，因此 RNA 必须先转化为 DNA，然后 PCR 才能起作用。这种转化称为逆转录-PCR (RT-PCR)。逆转录酶是由逆转录病毒产生的酶。它的工作是将病毒 RNA 基因组复制到 DNA 中，以整合到受感染细胞的 DNA 中。一旦进入细胞 DNA，许多新的逆转录病毒就会产生并从细胞中释放出来。因此，病毒中逆转录酶的发现使 RNA 的 PCR 成为可能。

实时 PCR 的商业化：

第一台商用实时 PCR 仪器由 Applied Biosystems 于 1996 年制造。该仪器可实时监测 PCR 管中的荧光。使用两个引物和一个探针测量 DNA 生成。探针的一端连接荧光染料，另一端连接淬灭染料。当探针完好无损时，淬灭剂会停止荧光。探针靠近其中一个引物。当 Taq 聚合酶复制 DNA 时，它会切断探针并释放染料和淬灭剂。淬灭剂不再足够近以停止荧光，因此会发出光。然后相机记录荧光。PCR 循环期间，可以在计算机屏幕上实时看到 PCR 过程中 DNA 的增加。

矢量图形。基于探针的 qPCR 反应步骤。步骤 1，qPCR 使用两个引物和一个探针（淬灭染料停止荧光。步骤 2，Taq 聚合酶切断探针。步骤 3，染料现在发出荧光并被相机捕获。步骤 4，扩增的 DNA 实时显示在计算机屏幕上。角落处有一个 ClevaLab 徽标。

实时 PCR 的基本原理：

实时 PCR（也称为定量 PCR (qPCR)）的功能在于查看 PCR 何时在每个循环中加倍而不停止反应。在此加倍阶段，可以量化 DNA。在 qPCR 的前几个循环中，荧光量低于相机的检测限。然后，随着 DNA 的积累，管中的荧光变得可检测到背景。此时，荧光每个循环加倍。这种加倍是指数增长阶段。随着数百万份 DNA 拷贝的积累，反应减慢到线性速率，然后达到稳定状态。更高的DNA 的起始量越大，PCR 越早出现在背景之上。使用阈值线测量不同样本中的 DNA 量。荧光超过此阈值的点是 PCR 的循环阈值或 Ct。阈值设置在背景之上，在 PCR 的指数期期间。Ct 值是样本中 DNA 含量的度量。

矢量图形。qPCR 扩增曲线的剖析。计算机屏幕显示 qPCR 扩增曲线。有标签：背景、阈值线、循环阈值 (Ct)、指数增长期、线性速率、平台期、试管 1 和试管 2。角落里有一个 ClevaLab 徽标。

但是，Ct 值不能告诉您试管中 DNA 的确切量。它只能告诉您一个相对量。例如，Ct 为 10 的样本的 DNA 含量是 Ct 为 11 的样本的 2 倍。这意味着 2 个循环的差异意味着 DNA 含量增加 4 倍，而 20 个循环的差异意味着 DNA 含量增加 100 万倍！因此，如果您想知道试管中 DNA 的确切拷贝数，则需要将其与已知量（称为标准）进行比较。涵盖整个 qPCR 循环范围的标准可以制作标准曲线。然后，当您知道样本的 Ct 时，您可以从标准曲线中读取 DNA 拷贝数。

矢量图形。qPCR 标准曲线。计算机屏幕显示 qPCR DNA 扩增曲线。已知 DNA 拷贝数从 100 万份到 10 份的样本已扩增。从另一个计算机屏幕上显示的生成标准曲线中读取未知的 DNA 量。角落里有一个 ClevaLab 徽标。

多重 qPCR：

也可以在同一试管中扩增多个 DNA 目标。每个目标使用带有不同颜色染料的探针。每个引物和探针组可以靶向 DNA 中的不同位置。或者甚至是序列中的微小变化。这种变化可以小到 DNA 序列中的一个核苷酸。

矢量图形。多重 qPCR。不同颜色的探针可以靶向 DNA 中的不同位置。两组引物和探针与 DNA 结合。一个探针有蓝色染料，另一个有绿色染料。核心部分是 ClevaLab 徽标。

PCR 和 qPCR 如何使用？

PCR 和实时 PCR 有许多用途。例如，在诊断疾病和医学研究中。最先想到的是检测呼吸道感染中的病毒和细菌。

我们大多数人都曾接受过拭子或唾液样本的检测。从该样本中，PCR 用于识别存在哪些病毒或细菌。一个 PCR 反应中的不同颜色探针允许在一次 PCR 中检测多个目标。例如，一次测试通常可以检测甲型流感、乙型流感和 SARS-CoV-2。这些测试是是/否测试，这意味着它们会报告是否检测到病毒或细菌。但对于 COVID-19，实时 PCR 的 Ct 值也有助于接触者追踪。低 Ct 意味着该人体内有大量病毒，更有可能具有传染性。随着时间的推移，测试可以判断该人是处于感染的早期还是晚期，以及他们何时具有传染性。

矢量图像。qPCR。检测呼吸道感染。从鼻腔中取出拭子。每种病毒都有不同颜色的 qPCR 探针。如果病毒存在，结果为是或否。角落里有 ClevaLab 标志。

PCR 的发现是一个奇妙的见解。PCR 可以诊断疾病并加深对生物学的理解。