【佳学基因检测】在胎儿期进行的基因矫正治疗

胎儿基因治疗最早是在 20 世纪 90 年代末提出的，当时，用 Gartner 炒作周期的话说，基因治疗领域正处于“过度预期的顶峰”。基因治疗当时仍是一个不成熟的领域，但在随后的十年里，它逐渐成熟，现在已成为临床和市场的现实。多种遗传病的治疗轨迹是早期干预。早期（宫内）诊断遗传病的能力、容量和意愿正在日益提高。如今，临床试验的汇合预示着胎儿基因治疗的发展轨迹。在佳学基因进行的综述中，遗传病的基因治疗在更广阔的领域中回顾了胎儿基因治疗的历史，讨论了胎儿手术和诊断的进展，并探索了遗传代谢病临床前基因治疗的全部范围。

基因治疗和胎儿基因治疗的历史

胎儿基因治疗的概念与基因治疗领域本身一样古老。在佳学基因的知识库中，遗传病的基因治疗将从总体历史角度探讨胎儿基因治疗的前景，特别是针对遗传性代谢疾病的前景。  

20 世纪 70 年代重组 DNA 工程的进步为基因工程的出现提供了基本工具。哺乳动物基因工程作为一项纯科学事业，推动了腺病毒、逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒 (AAV) 基因治疗载体的发展。这些载体能够将遗传物质首先递送到细胞中，然后递送到小鼠胚胎（逆转录病毒）、兔子（腺病毒）和小鼠肺（AAV）中。这些技术为首次在小鼠体内进行胎儿基因递送实验奠定了基础，目的是进行基因标记和细胞谱系追踪。1986 年，提出了治疗性人类胎儿基因治。一年后，一项先锋研究证明了胎儿基因转移作为一种治疗方法的可行性和吸引力：成年猕猴和胎羊接受了用逆转录病毒载体转导的基因标记的成年同种异体干细胞。猕猴的植入效果不佳，而胎羊的植入效果良好。作者得出结论，“宫内移植/基因转移可以作为出生后基因转移的可行辅助手段，甚至可以作为在宫内诊断出严重遗传病时的替代方法”。1987 年，这些临床前数据被提交给美国国立卫生研究院重组 DNA 咨询委员会 (NIH RAC)，以申请进行胎儿基因治疗的人体临床试验）。  

另外，1990 年 9 月 14 日，一项临床试验开始，使用逆转录病毒介导的体外基因疗法治疗两名患有腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷 (ADA-SCID) 的儿童。到 1995 年，这项试验和第二次 ADA-SCID 试验提供了体外人类基因疗法的潜在治疗益处的证据。到 20 世纪末，NIH RAC 已批准了 43 项用于遗传性疾病产后基因治疗的临床试验方案。人们对人类基因治疗寄予厚望。  

1998 年 7 月，两项宫内基因治疗的“预方案”被提交给 NIH RAC，RAC 于 9 月召集了一个委员会进行审议。1999 年 1 月初，委员会主办了一次基因治疗政策会议，以考虑胎儿基因转移的科学、安全、法律、伦理和社会影响（美国国立卫生研究院，重组 DNA 咨询委员会，2000 年）。该报告承认产前基因治疗在治疗疾病方面具有巨大潜力。但是，它强调，在进行任何临床试验之前，需要更大量的临床前证据，并且基因治疗的技术进步也是必要的。1997 年 11 月，英国基因治疗咨询委员会 (GTAC) 新兴技术小组的任务是评估宫内基因治疗的潜力（英国基因治疗咨询委员会，1999 年）。  

在人们对宫内基因治疗产生兴趣的同时，宫内干细胞移植 (IUSCT) 的进展引起了人们的关注，并支持了对遗传疾病进行产前细胞和基因治疗的前提。 首例宫内骨髓移植于 1967 年，用于治疗与 Rh 血型同种免疫相关的先天性溶血病。 从 20 世纪 80 年代末到 90 年代，越来越多的 IUSCT 手术被用于治疗各种非免疫性先天性血液病，如重型β-地中海贫血、裸淋巴细胞综合征和慢性肉芽肿病，但这些手术要么没有获益，要么只获得非常部分和短暂的益处。到 20 世纪 90 年代末，已有 26 次宫内造血干细胞移植尝试，但只有两名患有 X 连锁严重联合免疫缺陷的患者显示出分裂嵌合导致免疫重建的治疗益处。提交给 NIH 的胎儿基因治疗预方案引发了激烈的争论。1999 年 7 月，《自然医学》杂志发表了支持（Billings 1999）和反对（Schneider 和 Coutelle 1999）胎儿基因治疗的论据。不幸的是，这些事件恰逢基因治疗史上最动荡时期的开始。  

1997 年，一项针对成人体内基因治疗的临床试验开始，使用腺病毒载体治疗鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症。1999 年 9 月13日，在接受基因转移 98 小时后，第 18 名患者 Jesse Gelsinger 死亡。最终发现，前 17 名患者在载体注射 48 小时后均出现发烧、肌痛、恶心或呕吐症状。无一显示出治疗效果。1999 年 12 月 8日，NIH RAC 会议召开，审议该试验及其诸多缺陷。大西洋彼岸，X 连锁严重联合免疫缺陷 (X-SCID) 的体外基因治疗临床试验已于 1999 年 3 月在巴黎的内克尔研究所和 2001 年 7 月在伦敦的大奥蒙德街儿童医院开始。两项试验都取得了令人鼓舞的结果。前两名巴黎患者的免疫系统完全重建。然而，2002 年 10 月，《自然》杂志报道，巴黎试验中的一名婴儿患上了白血病 ( Check 2002 )。最终，20 名婴儿中有 5 名患上白血病（尽管有 4 名得到了成功治疗。 2001 年 8 月，一项通过向股动脉注射 AAV2 治疗血友病 B 患者的试验启动。在高剂量组中，IX 因子表达达到生理浓度的 11% – 足以将重度血友病转变为轻度血友病。然而，免疫反应在五周后消除了表达。  

对于基因治疗领域来说，随后的五年是一段缓慢走向光明的旅程，无论是从比喻还是从字面意义上来说都是如此。遗传性夜盲症，即莱伯氏先天性黑蒙，通过在年轻成人中视网膜下注射 AAV2 载体来治疗。腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷 (ADA-SCID) 通过体外造血干细胞疗法治疗（这次没有白血病的证据）。2010 年和 2011 年，首次发表了使用嵌合抗原受体 T 细胞分别治疗淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的基因疗法报告。该领域康复的一个里程碑是，六名血友病 B 患者在向肝细胞静脉注射携带人类 IX 因子的 AAV8 后病情得到部分纠正。此后不久，在异染性脑白质营养不良、Wiskott-Aldrich 综合征和芳香酸脱羧酶缺乏症方面也取得了令人鼓舞的试验结果。所有这些改善都是在出生后接受者身上发生的，但对于确定基因治疗的潜在安全性和考虑宫内基因治疗非常重要。  

载体

没有一个单一的载体是万能的：每个载体类都有可用于特定用途的属性。  

源自腺病毒、呼肠孤病毒和单纯疱疹病毒的载体越来越多地用于溶瘤病毒疗法和疫苗。然而，它们的促炎特性使它们不适合持久治疗遗传性疾病。相反，慢病毒和 AAV 载体已成为治疗遗传性疾病的主要手段。慢病毒载体通常被配置为整合到宿主基因组中，因此适用于干细胞或快速分裂细胞的基因修饰，而载体基因组的稀释会带来问题。然而，进一步改造以禁用其整合到基因组中的能力后，它们已被证明能在小鼠胎儿颅内注射后介导持久的基因表达 ( Rahim 等人 2009 )，并已用于成年大鼠治疗局灶性新皮质癫痫 ( Snowball 等人 2019 )。慢病毒载体由核衣壳和来自质膜的包膜组成。载体向性由膜糖蛋白赋予，可以通过将天然糖蛋白换成另一种病毒的糖蛋白（如水泡性口炎病毒糖蛋白 (VSVg)）来改变。AAV 载体已被开发用于体内、局部和全身给药，以靶向不同的细胞和组织。单链 DNA 有效载荷被包裹在裸露的二十面体衣壳中。载体向性通过衣壳的配置进行改变。从历史上看，这些来自“野生”的替代 AAV 血清型。最近，使用一系列衣壳工程技术创建了新型合成衣壳变体。载体有效载荷中唯一残留的病毒序列编码了对载体生产和功能至关重要的倒置末端重复序列 (ITR)。在大多数 AAV 载体中，ITR 通常源自 AAV 血清型 2，因此通常将其命名为 AAV2/x，其中 x 为衣壳。通常将其缩写为 AAVx，以仅描述衣壳。  

多年来，基因治疗要么是“病毒”的，要么是“非病毒”的：病毒分解后，它们就无法复制、不致病，但仍保留了它们进化而来的基因传递优势。或者，将遗传物质（通常是 DNA）与阳离子聚合物（脂质体）结合，可以形成新的合成实体，能够包装长段遗传物质，这些遗传物质可以相对无害地传递，但代价是效率低下和短暂性。与非病毒方法相比，病毒载体在将 DNA 传递到细胞核中的效率要高得多，可以实现持久的基因表达，但代价是传递的遗传物质长度（病毒包装能力）受到限制，并且有可能引发免疫反应或导致基因毒性。在 2000 年代和 2010 年代，病毒载体占据了主导地位，在临床试验中不断获胜。  

大多数基因治疗试验，尤其是使用病毒载体的试验，都是基因补充，因为它们在隐性疾病或单倍体不足的情况下提供额外的基因工作副本。基因传递不太可能恢复所有靶细胞的生理表达，但可能在某些细胞群中实现过度表达。有些适应症比其他适应症更能耐受这种疗法。成人血友病 B 的基因治疗可能导致因子 IX 蛋白的超生理表达，但仅限于一小部分肝细胞。尽管如此，这些细胞耐受过度表达并有助于产生足够的循环蛋白浓度以提供治疗益处。传统基因治疗仍然是一种钝性工具；由于遗传有效载荷通常保持游离或半随机整合，因此失去了表达的天然调控。因此，如果过早传递，不仅可能在错误的组织中发生不适当的表达，而且也可能在发育的错误时间发生。此外，最近也证实 AAV 会发生半随机整合，这引发了安全问题。  

最近，非病毒技术已证明其在瞬时表达是可以接受的甚至是可取的应用中提供 mRNA 的价值。例如，在临床上，它已被用于提供 mRNA 作为疫苗，反义 RNA 用于治疗脊髓性肌萎缩症，并且在单独的研究中，通过提供 siRNA和基因编辑机制（模板加 Cas9 mRNA）来治疗遗传性转甲状腺素淀粉样变性。最近，Gao和 Riley分别通过向小鼠胎儿注射脂质纳米颗粒并经卵黄管注射，独立证明 mRNA 主要输送到肝脏。  

为什么要进行胎儿基因治疗：与产后干预相比，胎儿干预具有哪些潜在的生物学优势？

“为什么要进行胎儿基因治疗？”这个问题有两种不同的含义，随着基因治疗的成熟，重点也发生了变化。在千禧之际，当 NIH RAC 表示需要进行更多的临床前研究时，对这个问题的共识解释是考虑潜在的生物学优势。  

潜在的优势包括：i) 在发生不可逆的病理变化之前预防疾病 ii) 利用胎儿免疫系统的耐受性 iii) 更有效地将遗传物质输送到出生后可能较难获得的生物区室 iv) 输送到胎儿体内更丰富的干细胞和 v) 由于胎儿体重较低，因此需要的载体较少。这些优势中的每一个都已通过二十多年的研究得到验证。  

胎儿期和产后治疗的比较

将胎儿和新生小鼠的相对年龄和发育阶段与人类胎儿和新生儿的发育进行比较是一个复杂的过程。尽管如此，仍有少数研究直接或间接地比较了胎儿和新生小鼠的干预措施。在用基因疗法治疗低磷酸酯酶症方面，Sugano 等人证明胎儿治疗优于新生儿干预，可能是因为软骨细胞转导得到改善。新生儿基因疗法彻底改变了人类 I 型脊髓性肌萎缩症的治疗，早期治疗可改善临床结果。这些临床发现得到了早期里程碑式研究的支持，这些研究证明用 AAV9 载体治疗敲除小鼠后具有治疗益处，尽管最近有一项研究因报告不一致而被撤回。 Rashnonejad 及其同事证明了通过在基因敲除小鼠中腹膜内注射 AAV9 进行胎儿基因治疗的可行性。有趣的是，他们治疗的小鼠没有出现新生儿基因治疗后出现的耳朵和尾巴坏死。对于戈谢病基因治疗，Massaro 及其同事比较了小鼠胎儿和新生儿脑室内注射。只有胎儿干预才能完全防止神经元丢失。这与基因敲除新生儿在出生时已经存在严重生化异常和炎症的观察结果一致。  

生物分布和神经系统

大量临床前研究表明，载体在生命早期和晚期注射时表现出不同的向性。一项具有里程碑意义的小鼠研究表明，新生儿静脉注射 AAV9-GFP 主要导致神经元表达，而成人注射主要产生星形胶质细胞转导。在小鼠中，在妊娠 16 天时将 AAV9-GFP 注射到胎儿卵黄血管中比通过颞浅静脉注射到新生儿中实现更强的神经元表达。这通常归因于出生后不久血脑屏障的收紧，但血脑屏障的概念很复杂且常常被误解。在妊娠 18 周时已观察到人类血脑屏障各组分的组装。 Saunders 及其同事反驳了早期血脑屏障不成熟或功能障碍的观点，并提出“……大脑发育的任何特定阶段存在的特定屏障机制都是适合该发育阶段的机制……”（Saunders 等人，2018 年）。因此，不同年龄出生后表达的差异可能代表不同的分子屏障、病毒受体分布和细胞内病毒运输机制等。  

胎儿免疫系统

胎儿基因治疗的一个潜在优势是利用胎儿免疫系统的耐受性。胎儿耐受性是多因素的，涉及许多细胞类型，包括调节性 T 细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞。有证据表明胎儿环境并非无菌，胎儿免疫系统能够产生适应性免疫反应。许多研究（包括本文所述的研究）已证明胎儿分娩后基因仍会长期表达。在某些情况下，胎儿基因传递已被证明可以避免免疫介导的功效消除，而这种功效消除阻碍了成人基因传递。然而，只有少数人明确质疑这种耐受性或探究其潜在机制。2003 年，人们使用腺病毒血清型 5 载体对胎儿小鼠和成年小鼠的人类 IX 因子基因传递进行了比较。腺病毒血清型 5 载体通过与凝血因子 X 相互作用在肝脏中转导效率极高。成年注射的小鼠表达高血浆浓度，但 40 天后表达消失，与产生高浓度抗 IX 因子抗体一致。反复注射人 IX 因子蛋白会产生越来越强的抗 IX 因子抗体反应。相反，在子宫内注射的小鼠会表达 IX 因子长达至少 250 天，但不产生抗 IX 因子抗体。出生后反复注射 IX 因子激发注射未引发抗 IX 因子抗体反应：它们对人 IX 因子产生了耐受性。进一步的实验提供了证据表明，CD4 + /CD25 +调节性 T 细胞维持了耐受性。Sabatino 及其同事使用 AAV1 载体和人类因子 IX 在小鼠身上进行了类似的实验，观察了胎儿分娩后的免疫耐受性。重要的是，他们观察到了 T 细胞免疫耐受的证据。最近，胎儿基因传递已被证明可在接受 AAV6.2 和 AAV8-GFP 的绵羊和接受 AAV5-因子 X 的猕猴中诱导对转基因蛋白的出生后免疫耐受性。  

有趣的是，已有出版物报道了小鼠胎儿基因载体传递、小鼠基因修饰造血干细胞以及大鼠、绵羊和猴子中的免疫反应。可能的解释是某些基因产物的耐受性低于其他基因产物（考虑到临床前实验中的大多数基因是人类的，并且与临床前模型不同），并且某些传递方式可能耐受性更强或促炎性更低。  

随着遗传病的基因治疗不断加深对胎儿基因治疗生物学原理的基础知识，出生后基因治疗也取得了良好的进展。对于某些适应症，例如脊髓性肌萎缩症（Chand 等人 2021）和血友病 A（Mahlangu 等人 2023）和血友病 B（Pipe 等人 2023），可针对升高的血清丙氨酸转氨酶提供免疫抑制。然而，在许多向中枢神经系统定向输送的情况下，已经证明免疫抑制是不必要的，例如将 AAV2 直接输注到黑质和腹侧被盖区（Pearson 等人 2021）。脑实质内输送后，不良免疫学事件的报告较少，可能是因为载体剂量较低，渗漏到循环中的量极小。  

如上所述，人们已经考虑了诱导对载体成分的免疫耐受的可能性。一方面，这可能允许重复的产后载体再给药。另一方面，这可能会损害对载体来源病毒的免疫力（Senut 和 Gage 1999）。然而，这些担忧可能会被几项研究所缓解。在妊娠 60 天（妊娠期 145 天）时通过腺病毒载体接受 lacZ 的绵羊在妊娠 125 天时再次注射时表现出强烈的抗腺病毒抗体反应（Yang 等人 1999）。  

通过腺病毒载体将人类 IX 因子胎儿递送给小鼠，仅导致对人类蛋白质而非腺病毒载体的免疫耐受。随后给成年人注射载体导致高 IX 因子表达，但也诱导了抗腺病毒抗体。第二次腺病毒注射并没有进一步增加 IX 因子表达，但引起了更强烈的抗体反应（Waddington 等人，2003 年）。同样，虽然在 AAV 载体介导的胎儿分娩后会诱导对转基因的耐受性，但并未观察到对 AAV 载体本身的耐受性（Davey 等人，2017年）。据推测，在这两种情况下，这都是由于转基因蛋白的持续表达，但胎儿仅短暂暴露于病毒载体蛋白。因此，胎儿分娩是一种“免费注射”，因为它不会引起抗载体免疫反应，但也不会诱导耐受性。一项研究支持了这一观点，该研究的研究人员能够在子宫内注射一次 AAV1 因子 IX，然后在成年小鼠中重复使用相同载体进行注射（Sabatino 等人，2007 年）。同样，在子宫内 CRISPR 介导的基因编辑研究中，观察到在成人（而非胎儿）注射 AAV9（Bose 等人，2021 年）或腺病毒（Rossidis 等人，2018 年）以递送 SpCas9 碱基编辑器后会产生抗 SpCas9 抗体。  

基因传递本身的时间安排也值得考虑，而不是免疫系统的性质。成人免疫系统很可能遇到过原型病毒和细菌，从中可以开发出载体和基因编辑器。在首次血友病 B 临床试验之一中，对相应 AAV 血清型的预先存在的免疫力很可能导致转基因蛋白表达的丧失（Manno 等人，2006 年）。在后续试验中，这导致了对具有预先存在的抗病毒/载体免疫力的患者进行严格的排除标准（Nathwani 等人，2011 年）。抗载体中和抗体可能会限制有效的载体传递，而细胞毒性 T 细胞反应可能会消除载体转导的细胞。  

尽管胎儿免疫系统可能对这些病毒不敏感，但现有的母体 IgG 抗体甚至 T 细胞都能够穿过胎盘屏障，这可能足以消除任何有效的转基因蛋白表达。这在 AAV 介导的基因转移中很重要，因为已有的抗 AAV 免疫反应已被证明可以以血清型特异性的方式限制胎儿基因编辑（Riley 等人 2022 年），并且已有的母体 T 细胞对 AAV 的免疫已被确认可以消除已用载体转导的细胞（Manno 等人 2006 年）。  

潜在风险

隐含且始终被考虑的问题是“胎儿基因治疗的潜在生物学风险是什么？ ”。NIH RAC 和英国 GTAC 委员会编制了一份这些风险的清单，尽管许多风险并非胎儿基因治疗所独有。  

首先是害怕癌症，源于人们认识到胎儿可能很容易被传导，而且快速分裂的胎儿组织可能容易受到致癌整合事件的影响。研究报告称，给胎儿或新生小鼠注射源自马传染性贫血病毒（Themis 等人 2005；Themis 2012）和猫免疫缺陷病毒（Condiotti 等人 2014）的慢病毒载体后，会形成肝细胞癌，但注射基于 HIV 的慢病毒（Waddington 等人 2004）不会形成肝细胞癌。小鼠注射某些 AAV 载体后也会检测到癌症（Chandler 等人 2015）。X-SCID 患者接受基因修饰造血干细胞移植后发生的白血病在一些情况下是由载体整合在原癌基因附近和上调引起的（Howe 等人 2008）。因此，癌症风险并非胎儿治疗所独有。  

其次，生殖系传播是主要问题。从法律上讲，基因治疗仅限于体细胞；生殖系基因改造是被禁止的，而且不是胎儿基因治疗的目的。20 世纪 90 年代末的胎儿基因治疗预方案遭到了批评，人们认为它们“可能会导致胎儿生殖系细胞的基因变化”（King 等人，1999 年）。 Porada 及其同事证明，在将逆转录病毒载体递送至胎儿绵羊后，可以实现低水平的生殖系传播（Park 等人，2009年）。在将慢病毒载体注射到胎儿猕猴的腹膜内后，Lee 及其同事发现了卵巢上皮细胞中有转基因表达的证据，但在雄性或雌性生殖细胞中没有发现（Lee 等人，2005 年）。在宫内注射慢病毒载体的小鼠（ Waddington 等人，2003 年）或注射腺病毒载体的胎羊（David 等人，2003 年）的精子中未发现载体序列。在成年后注射 AAV2 载体的兔子精液中发现了这些载体序列（Schuettrumpf 等人，2006 年），在出生后人类血友病 A 基因治疗试验后长达 12 个月的精液中检测到了 AAV5 序列，尽管在精子中未检测到载体 DNA（Rangarajan 等人，2017 年）。在接受 AAV9 基因治疗脊髓性肌萎缩症的两名婴儿中，在睾丸中检测到了载体基因组，在卵巢中检测到了基因组和 RNA 转录本。因此，这种风险并不仅限于胎儿基因治疗（Thomsen 等人，2021 年）。  

代谢基因的临床前基因转移

除免疫缺陷外，ADA-SCID还表现出代谢紊乱，导致神经发育迟缓、肌张力异常和耳聋。该病的治疗方法是捐献造血干细胞移植、酶替代疗法以及最近的基因疗法。尽管这是第一个从基因疗法中受益的人类疾病（Blaese 等人 1995 年；Bordignon 等人 1995 年），并且正在向 NIH RAC 提交一份预方案，以使用经逆转录病毒载体修正的造血干细胞对 ADA-SCID 进行胎儿基因治疗（美国国立卫生研究院。重组 DNA 咨询委员会 2000 年），但尚未有关于胎儿基因治疗的研究，即使在动物模型中也是如此。然而，已经有许多研究描述了至少十种不同代谢疾病的临床前模型中的胎儿分娩。  

泰-萨克斯病是一种 GM2 神经节苷脂沉积症和鞘脂沉积症，由己糖胺酶 A 突变引起。婴儿型表现为新生儿神经变性和早期死亡。1996 年，Lacorazza 及其同事将神经祖细胞注射到 E14.5 小鼠体内，这可能是代谢疾病临床前胎儿基因治疗的第一个例子。这些细胞已使用嗜亲性逆转录病毒进行基因改造，以过度表达己糖胺酶 A。研究人员报告称，神经祖细胞分泌酶，并交叉校正邻近细胞，达到他们估计在相关模型中具有治疗作用的浓度（Lacorazza 等人，1996 年）。  

瓜氨酸血症 I 型(CTLN1) 是一种由精氨琥珀酸合成酶突变引起的尿素循环障碍。在最严重的形式中，血液和脑脊液中氨的积累会导致癫痫发作、脑损伤和肝功能衰竭。使用腺病毒载体通过肝内注射将人精氨琥珀酸合成酶递送到妊娠 15 天的该疾病小鼠模型中。治疗将生存期从三天延长到十天（Ye 等人 2001 年）。非整合腺病毒载体的稀释是该年龄快速肝脏生长和细胞分裂的结果（McKay 等人 2011 年），可能是表达丧失的原因。  

粘多糖贮积症 VII 型（Sly 综合征）是一种溶酶体贮积症，由GUSB基因编码的 β-葡萄糖醛酸酶缺乏引起。在最严重的情况下，该病可在宫内表现为胎儿积水、胎盘肿大和羊水过多。目前已建立了良好的小鼠模型。亲嗜性或兼嗜性逆转录病毒载体用于将GUSB递送至小鼠胎儿肝细胞，而小鼠肝细胞是造血干细胞的来源。这些细胞在妊娠 13.5 天时被注射到胎盘中。在新生儿组织中检测到了载体序列，但未报告治疗效果（Casal 和 Wolfe 1997）。随后进行的类似实验导致在 60 天时检测到酶活性和轶事表型改善，但任何治疗效果在 214 天时都消失了（Casal 和 Wolfe 2001）。通过将 AAV1 注射到胎儿脑室中来传递基因，可使载体传递至整个脑部，并产生强烈的 β-葡萄糖醛酸酶表达、分泌和交叉校正。存活率显著提高，最长可达一年，尽管内脏表达的缺失解释了骨骼异常无法纠正的原因（Karolewski 和 Wolfe 2006 年）。第二组将 GUSB 腺病毒血清型 5 传递到胎儿小鼠脑侧脑室。尽管组织学上酶分布稀疏且脑酶活性适中（约为正常值的 3-10%），但在 120 天时，脑溶酶体糖胺聚糖的积累得到阻止（Shen 等人 2004 年）。  

糖原累积病 II 型（庞贝病）是一种因酸性 α-葡萄糖苷酶缺乏引起的溶酶体贮积病。它会导致进行性肌无力，严重时可表现为胎儿肥厚性心肌病（Hamdan 等人，2010 年）。Rucker 及其同事比较了通过胎儿肝内注射两种 AAV 血清型来递送人类 GAA 编码区的情况。表达主要在横膈膜中观察到，可能是由于载体漏入胎儿腹腔所致。AAV2 治疗的小鼠横膈膜中表达了超生理性的 α-葡萄糖苷酶表达，收缩力部分恢复。AAV1 治疗的小鼠实现了更高的表达（Rucker 等人，2004 年）。AAV1 也是将人类 GAA 递送到两只晚期妊娠第一期恒河猴腹腔的首选载体（Conlon 等人，2016 年）。  

Crigler–Najjar 1 型糖尿病是由编码胆红素 UDP-葡萄糖醛酸转移酶的 UGT1A1 基因突变引起的。缺乏该酶会导致血清未结合胆红素浓度过高，从而导致脑损伤和死亡。Seppen 及其同事发表了两项研究，使用慢病毒载体通过宫内肝内注射将人类UGT1A1递送到妊娠 19 天的患有该病的大鼠模型中。他们观察到高胆红素血症得到纠正，效果持续一年以上（Seppen 等人 2003 年；Seppen 等人 2006 年）。  

人类红细胞 R 型丙酮酸激酶缺乏症是由 PKLR 基因突变引起的。它会导致慢性非球形溶血性贫血。临床表现具有广泛的异质性，但纯合和复合杂合突变可导致严重贫血（Yozgat 等人 2020 年）。通过向胎儿肝内注射携带人类 R 型丙酮酸激酶基因的逆转录病毒载体转导的造血干细胞，实现了对小鼠模型的部分纠正（Meza 等人 2009 年）。  

低磷酸血症是另一种临床异质性疾病，最严重的情况是，新生儿因呼吸衰竭、高钙血症和无法控制的抽搐而死亡（Nakamura-Utsunomiya 等人，2010 年）。潜在缺陷是组织非特异性碱性磷酸酶 ( TNALP ) 基因，该基因参与骨矿化途径。Sugano 及其同事比较了腹膜内 AAV9 载体注射对胎儿（E15）和新生儿 TNALP 基因敲除小鼠的影响。胎儿注射将中位生存期从 10 天延长至至少 8 周；癫痫发作消失，骨矿化恢复（Sugano 等人，2012 年）。  

戈谢病是由溶酶体酶葡萄糖脑苷脂酶突变引起的，具有一系列临床表现。较轻的成人形式表现为肝肿大、脾肿大、疲劳和无血管性骨危象。可通过酶替代和底物减少疗法进行治疗。严重的酶缺乏会导致急性神经性戈谢病，表现为吞咽困难、癫痫发作和发育迟缓，在极端情况下，还会出现胎儿积水和鱼鳞病（Daykin 等人，2021 年）。葡萄糖脑苷脂酶基因敲除小鼠会出现四肢轻瘫，活不过 15 天。在妊娠 16 天时将 AAV9 注射到这些小鼠的大脑侧脑室中，可将生存期延长至至少 18 周。神经退行性病变消失，神经炎症得到显著改善。新生儿脑室内注射也取得了类似的效果，但未能完全防止神经元丢失（Massaro et al 2018）。  

酪氨酸血症 I 型是由突变的延胡索酰乙酰乙酸水解酶 ( FAH ) 引起的。上游代谢物的积累会导致肝脏和肾脏疾病以及神经病变。患者可能从婴儿期到成年期出现症状，新生儿会患上急性肝衰竭、凝血病和腹水。医疗管理是口服尼替西农加低酪氨酸和苯丙氨酸饮食。尼替西农可抑制位于FAH上游的酶 4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶 (HPD) ，从而防止中间毒性代谢物的积累（de Laet 等人，2013 年）。Rossidis、Peranteau 及其同事在 FAH 基因敲除小鼠模型中进行了概念验证胎儿碱基编辑。编辑器旨在引入相同 HPD 基因中的无义突变，在妊娠 16 天时使用腺病毒载体通过静脉注射到胎儿卵黄血管中。未经治疗的小鼠无法存活超过约 3 周，并且会出现高胆红素血症和血液肝酶升高。宫内基因编辑挽救了致死表型，动物体重增加和存活率与使用尼替西农维持的未编辑病鼠相同（Rossidis 等人，2018 年）。  

治疗IH 型粘多糖贮积症(MPSIH，Hurler 综合征)的尝试首先采用体外基因疗法，在此疾病中异基因骨髓移植成功之后。MPSIH 是由 α-L-艾杜糖醛酸酶突变引起的。将编码 α-L-艾杜糖醛酸酶的逆转录病毒载体转导的造血干细胞在妊娠中期（≈30 天）注射到 MPSI 犬的卵黄囊中。12 个月时在骨髓（高达 12%）和循环中检测到了转基因细胞，但是检测不到酶（Lutzko 等人，1999 年）。三年后，研究人员重复了这些实验，但使用相同的胎儿途径直接注射逆转录病毒。仅在一只死产幼崽的肝脏和肾脏中检测到酶活性，而在其余七只幼崽中未检测到。在实验的四个月期间，原病毒拷贝数下降（Meertens 等人，2002 年）。最近，在携带 G→A（色氨酸→终止）突变的 α-L-艾杜糖苷酶小鼠模型中，通过双 AAV 裂解内含肽方法将碱基编辑器递送到妊娠 15.5 天的卵黄管中，该突变重现了许多 MPSIH 患者中存在的常见 G→A (W402X) 突变。这项研究表明，与产后碱基编辑相比，产前碱基编辑显著提高了生存率，改善了代谢、肌肉骨骼和心脏疾病，并且一些结果指标有所改善（Bose 等人，2021 年）。  

为什么要进行胎儿基因治疗：在什么情况下人类胎儿基因治疗是合理的？

要将胎儿基因治疗转化为临床治疗，必须满足几个标准。它必须在技术上可行，必须有准确及时的产前诊断，并且必须比产后干预有明显的优势。  

胎儿基因传递的实际考虑

正如电影《谍影重重4》中 Marta Shearing 博士的角色所说，“将 [基因治疗载体] 送到你想要的地方，以你想要的方式，是一场噩梦”（Gilroy 2012）。载体配置和给药途径都是成功基因转移的关键决定因素。对一些人来说，将基因输送给胎儿似乎是一件不可思议的事情，但胎儿手术早在 60 多年前就已建立，如今已成为一门成熟的学科。  

1961 年，Albert Liley 在 X 射线引导下对一名被诊断为恒河猴病的胎儿进行了腹腔内输血（Liley 1963）。先驱 Michael Harrison（Evans and Harrison 2021）提供了出色的个人经历和对该领域的回顾。1981 年，利用胎儿镜可视化技术实现了向绒毛板血管的直接血管内输血（Rodeck 等人 1981），并进行了改进以治疗胎儿出血性疾病、细小病毒 B19 感染和母体同种免疫（Daffos 等人 1983）（Daffos 等人 1988）。如今，胎儿贫血通常可以通过脐静脉注射胎儿输血来安全治疗（Prefumo 等人 2019）。还研究了其他给药途径，例如通过母体循环或胎盘内注射，但这会将大量的载体剂量输送到母体组织。因此，这些方法（已在小鼠身上得到证实）可能仍是科学研究领域的工具（Nakamura 等人 2019 年；Nakamura 等人 2020 年），临床产前基因治疗可能通过脐静脉或心内注射（全身给药途径）或脑室内注射进行，以专门针对中枢神经系统。  

尽管对胎儿进行血管内或脑室内分娩最初可能看起来是异想天开的，但重要的是要将其置于更先进的外科手术干预的背景下，这些手术干预目前在专门的多学科胎儿治疗中心很常见，用于治疗结构性出生缺陷的胎儿。例如，可以在膀胱和羊膜腔之间放置分流器来治疗下尿路梗阻。同样，在胸腔之间放入羊水中的分流器可以引流胸腔积液，如乳糜胸和胸水，或用于引流大的囊性肺病变（Peranteau 等人，2015 年）。球囊瓣膜成形术用于治疗左心发育不全综合征的特定病例。胎儿内镜气管闭塞术用于治疗先天性膈疝（Deprest 等人，2021 年；Deprest 等人，2021 年）。尤为令人印象深刻的是脊髓脊膜膨出的胎儿手术的发展，目前该手术已成为符合特定标准的母亲和胎儿的常规临床实践（Sacco 等人，2018 年）。这是脊柱裂最严重的形式，脊柱闭合不全，随后发生后脑疝，脊髓暴露于羊水的有害影响。大多数神经管缺陷病例是散发性的，但受影响个体的兄弟姐妹复发风险很高。同型半胱氨酸再甲基化基因MTHFR的变异是某些人类群体的危险因素（Greene 等人，2009 年）。一项关于产前与产后手术的随机试验（Adzick 等人，2011 年）提供了 I 级证据，表明胎儿手术比产后手术有更好的结果（Iskandar 和 Finnell，2022 年）。  

针对遗传病的胎儿治疗（但不是基因治疗）

胎儿输血越来越多地用于治疗重型 α 地中海贫血 ( Horvei et al 2021 ) 和其他罕见贫血，尽管输血诊断出的代谢疾病（例如丙酮酸激酶缺乏症 ( Maisonneuve et al 2022 )）仍然不常见。胎儿干细胞移植已应用于一系列遗传疾病，包括代谢疾病，例如急性神经病变 (II 型) 戈谢病、Hurler 综合征和尼曼匹克 A 型（详见 ( de Coppi et al 2022 )）。  

目前有两项临床试验正在进行中，分别使用造血干细胞和间充质干细胞治疗重型 α-地中海贫血（NCT02986698）和成骨不全症（Gotherstrom 等人 2014 年；Götherström 等人 2021 年）（NCT03706482 ）。  

产前基因治疗治疗妊娠并发症

产科疾病本质上只能在分娩前治疗。  

早产是指妊娠 37 周前分娩；40% 的早产病例与感染有关。最近，Suff 及其同事描述了宫颈阴道 AAV 基因治疗对小鼠早产模型的保护作用，该模型由在妊娠 16.5 天时阴道内注射发光大肠杆菌引起。预防性宫颈应用携带抗菌肽人类 β-防御素-3 (HBD3) 的 AAV8 载体可减少细菌从阴道通过宫颈上升，并显著增加活产幼崽的数量，尽管未观察到对胎龄的影响（Suff 等人，2020 年）。  

子宫胎盘灌注受损会导致胎儿生长受限。David 及其同事通过施用腺病毒血清型 5 载体将 VEGF-A 输送到子宫动脉，恢复了豚鼠（Swanson 等人 2016 年；Vaughan 等人 2018 年）和绵羊（Carr 等人 2014 年）胎儿生长受限模型中的胎儿生长和子宫动脉血流。在绵羊胎儿生长受限模型中，母羊营养不足以损害胎盘生长并限制羔羊出生体重，基因疗法改善了胎儿生长以及出生后的生长率（Carr 等人 2014 年）。正在进行的工作是完善首次人体 EVERREST 临床试验的纳入和排除标准，该试验旨在通过基因疗法提高患有重度早发性 FGR 的孕妇子宫动脉中的 VEGF 水平（Spencer 等人 2017 年）。  

胎儿诊断。最大的障碍。

一种疾病若要成为胎儿基因治疗的合适目标，准确的宫内诊断至关重要。1980 年，Rodeck 首次描述了使用胎儿镜直视抽取胎儿血液（Rodeck 1980）。不久之后，Daffos 报告了现在使用的技术，即在连续超声引导下从脐带抽取血液。在先证者中，胎儿异常通常首先通过超声发现。此类异常可能由一系列基因畸变引起，包括非整倍体、较小 DNA 片段的缺失或重复以及单核苷酸变异。一旦检测到异常，可以提供侵入性产前诊断程序：绒毛取样、羊膜穿刺术或胎儿血液取样。如果怀疑有溶酶体贮积症，对绒毛样本进行酶促分析是诊断的有效方法（Verma et al 2015）。质谱法和气相色谱/质谱法为代谢疾病的诊断提供了有价值的代谢物测量方法。羊水分析已用于诊断一系列疾病，包括丙酸血症（Dai 等人 2020）、甲基丙二酸血症和鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症（Shi 等人 2022 ）。可以通过荧光原位杂交 (FISH)、定量 PCR、多重连接依赖性探针扩增、染色体微阵列分析和拷贝数变异测序对特定基因进行靶向检测。成本的大幅降低和速度的提高预示着外显子组测序（Fu 等人，2022 年）和下一代测序（详见（van den Veyver 和 Eng，2015 年）和（Hillman 等人，2015 年））的采用。产前诊断越来越多地使用循环游离胎儿 DNA（Camunas-Soler 等人，2018 年）进行非侵入性诊断。这种非侵入性产前诊断 (NIPD) 的当前示例包括成纤维细胞生长因子受体 2（例如 Apert 综合征）和 3（ego 致死性发育不良）的突变（2022 年）。英国国家医疗服务体系 ( Emms 等人，2022 年)现已采用胎儿下一代。然而，即使为某种遗传病确定了一个或多个致病基因，在许多情况下，突变分布在整个基因的外显子和内含子中。一些显性疾病不是完全渗透的，因此基因诊断并不总是能预测疾病的严重程度甚至存在。因此，这些技术目前在已知致病变异的情况下最有用。最近已经详细探讨了对这些诊断选项的考虑（Sparks 和 Dugoff 2023)。遗传病最有力的指标之一是有一个或多个受影响的兄弟姐妹的诊断和家族病史（Wu 等人 2022；Wright 等人 2023）。  

对于某些疾病，可以进行可靠且具有预测性的基因诊断。脊髓性肌萎缩症是由常染色体生存运动神经元 1（SMN1）基因的双等位基因缺陷引起的。生存运动神经元 2（SMN2 ）基因在进化过程中作为串联染色体重复出现，个体可能拥有 0-8 个拷贝。它可以部分补偿SMN1的丢失。SMN2 拷贝数决定疾病的严重程度。最近一项针对脊髓性肌萎缩症的新生儿试验招募了携带两个拷贝的患者；如果不进行治疗，预期寿命通常不超过两年。其中五名患者是通过产前检测确定的（Strauss 等人，2022 年）。现在，在存在已知 SMN1 突变的情况下，可以提供非侵入性产前诊断检测（Parks 等人，2017 年）。  

母亲

胎儿治疗不仅必须有利于产后干预并为胎儿提供益处和风险的良好平衡，还必须将对母亲的风险降至最低。这在其他评论中得到了更广泛的讨论（Rousseau 等人，2022 年）。最近，国际胎儿移植和免疫学学会（IFeTIS）在一份立场声明中对此进行了阐述。胎儿治疗的并发症可能]包括因胎儿出血、胎儿心动过缓、胎膜早破、感染和早产而需要紧急剖腹产（Sagar 等人，2020 年）。基因治疗特有的风险是载体可能穿过胎盘屏障进入母体循环，导致母体对载体或转基因蛋白的免疫反应，从而可能损害基因转移和母体健康。此外，在基因编辑时代，还必须考虑治疗药物泄漏到母体循环中导致母体基因编辑的风险。考虑到母亲的体重，按每公斤计算，输送给胎儿的剂量要小得多，这一事实可能会减轻人们对胎儿基因治疗以及母体编辑的母体免疫反应的担忧。此外，小鼠模型研究并未证明在通过 AAV 或腺病毒将 CRISPR 编辑构建体宫内递送给胎儿后发生任何母体基因编辑（Rossidis 等人 2018 年，Bose 等人 2021 年）。另一个潜在问题是母体生殖系基因转移。胎儿基因治疗不太可能导致母体生殖系基因转移，因为卵母细胞受到血卵泡屏障 (BFB) 的保护，并且载体在母体循环中的存在水平非常低（Siu 和 Cheng 2012 年）。然而，最近的一项研究表明，卵巢微注射腺病毒能够穿透 BFB 并传导颗粒细胞（Kanatsu-Shinohara 等人 2022）。在恒河猴中，胎儿分娩 AAV8 导致母体组织中跨胎盘基因转移（Mattar 等人 2011）。超声引导下腹膜内、脑室内或静脉注射 AAV9 载体会导致家猪胎猪早产；而生理盐水注射则不会引起早产（Rich 等人 2021）。相反，将 AAV9 注入另一种品系尤卡坦小型猪，在子宫切开后通过脐静脉注入该品系，可导致剖腹产后活产（Dave 等人 2023）。代谢疾病存在特定的产妇安全问题，因为胎儿代谢疾病可能会对母亲产生不利影响，例如表现为急性脂肪肝（Innes 等人 2000 年；Spronsen 等人 2005；Ramanathan 和 Ibdah 2022 ）。因此，某些胎儿代谢疾病的宫内治疗可能对母亲的健康有益。对母亲的其他潜在风险包括癌症，尽管成熟的成人组织可能比快速分裂的胎儿组织更不容易受到致癌整合事件的影响。胎儿基因治疗在如何告知母亲所有潜在风险方面提出了非常具有挑战性的问题，并且已被广泛考虑（Strong 2011）。父亲/伴侣也不应被遗忘，因为在大多数司法管辖区，他们将在婴儿出生后共同承担父母责任，因此应认识到他们在是否进行胎儿基因治疗的决定中具有重要贡献（Johansson 等人 2020）。应权衡胎儿治疗的益处与替代方案，无论是足月分娩并立即进行新生儿治疗，还是选择性早期剖腹产和出生时进行疾病管理。后一种情况以大型骶尾部畸胎瘤的治疗为例，这种畸胎瘤会使胎儿因血管窃血而面临心力衰竭的风险。在某些情况下，这些胎儿会在妊娠 28-32 周时择期分娩，以便对肿瘤的大血管成分进行减瘤手术，因为研究表明，延迟分娩会导致胎儿死亡率增加（Roybal et al 2011）。这里不会探讨父母对胎儿治疗的看法，但已经有一些研究和评论。女性普遍表示有兴趣参加可能使未出生婴儿受益的临床试验（Sheppard et al 2016）。Schwab 及其同事报告了对溶酶体贮积症的胎儿酶替代疗法（Schwab et al 2022）和脊髓性肌萎缩症的基因疗法（Schwab et al 2022）的赞成态度。最终，多学科、非指导性的产前咨询和知情同意对于宫内基因治疗的实施至关重要。  

下一步是什么？

1998 年提交人类胎儿基因治疗预方案的时机不太好，因为该领域进入了动荡时期。此外，更广泛的政治力量也在发挥作用；国立卫生研究院 RAC 的成员担心，在美国，“宫内干预可能会……影响政治敏感的堕胎相关问题和决定”（Fox 1998）。这些预方案也超前于时代。一位公众批评者写道：“到目前为止，人类基因治疗已经失败，而将这种失败作为将人类基因操作扩展到分化较低的细胞的理由，这似乎有些自相矛盾”（Billings 1999）。但情况已不再如此：针对遗传病的人类基因治疗已成为临床和商业现实。截至 2023 年 2 月，已有 8 种适应症获得上市批准。 Libmeldy (Atidarsagene autotemcel)、Skysona (Elivaldogene autotemcel) 和 Zynteglo (Betibeglogene autotemcel) 分别是用于治疗异染性脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良和 β-地中海贫血的体外慢病毒疗法。Hemgenix (Etranacogene dezaparvovec-drlb)、Luxterna (Voretigene neparvovec)、Roctavian (valoctocogene roxaparvovec)、Upstaza (Eladocagene exuparvovec) 和 Zolgensma (Onasemnogene abeparvovec ) 是用于治疗血友病 B、莱伯氏先天性黑蒙、血友病 A、芳香酸脱羧酶缺乏症和脊髓性肌萎缩症的体内AAV 疗法。还有更多药物获准进行临床试验（Iglesias-Lopez 等人 2021 年；Lee 和 Lee 2023 年）。  

现在，从几种遗传疾病的临床试验的轨迹和汇合中，出现了人类胎儿基因治疗进展的模板……  

历史上，I 型脊髓性肌萎缩症表现为神经肌肉疾病，通常在两岁前死亡。两种基因疗法的开发改变了治疗方法。第一种是 Nusinersen，以 Spinraza 的名称上市，是一种寡核苷酸，在四次负荷剂量后每三个月鞘内注射一次。Onasemnogene abeparvovec-xioi，以 Zolgensma 的名称上市，通过单次静脉注射 AAV9 载体来提供SMN1基因的工作拷贝（ Chilcott 等人，2021 年）。在一项基于方案的多中心前瞻性观察研究中，测量了注射后六个月内的运动评分（CHOP INTEND），8 个月以下儿童增加了 13.8 分，8 至 24 个月之间的儿童增加了 7.7 分，但 24 个月以上的儿童没有显着改善（Weiss 等人，2022 年）。 III 期 SPR1NT 试验现已提供疗效证据，即 14 名经基因诊断的婴儿在发病前（8 至 34 天大）接受治疗，与年龄较大时接受治疗的儿童相比，他们的发育结果有所改善，功能独立性也更好。本次试验中未观察到与治疗相关的严重 TEAE，这一观察结果进一步支持了有益的风险-收益分析。相比之下，在治疗年龄较大婴儿的 STR1VE-US13 试验中观察到了 3 例（Day 等人，2021 年）。作者认为，这可能是由于新生儿免疫系统对非自身抗原（包括衣壳蛋白）相对无反应所致。这项研究的几个方面支持更早的胎儿治疗方法：1）诊断——接受治疗的五名婴儿在产前得到诊断 2）疗效——治疗未能完全预防运动缺陷，因为五名接受治疗的儿童的贝利粗大运动评分低于正常范围 3）发病——八名婴儿被排除在试验之外，因为疾病已经可检测到。四名婴儿在诊断时出现临床症状，四名婴儿表现出神经动作电位降低 4）预先存在的免疫力——两名婴儿被排除在试验之外，因为他们有抗 AAV9 抗体（尽管这些抗体可能是通过母体传播的）（Strauss 等人，2022 年）。  

患有血友病 A 和血友病 B 的成年人最初只能通过输注血浆衍生因子浓缩物来治疗。在 20 世纪 90 年代，在发达国家，这种方法被重组凝血因子注射所取代。2022 年，首个“一次性”基因治疗产品获得批准（Sheridan 2022）。溶酶体贮积症患者也呈现出类似的模式：目前，酶替代疗法和底物抑制/耗竭是一线治疗方法，但现在正在招募患者进行基因治疗试验（Sevin 和 Deiva 2021）。由外胚层发育不良 A 基因突变引起的 X 连锁少汗性外胚层发育不良表现为汗腺和牙齿形成障碍。作为一种发育性疾病，新生儿治疗为时已晚。两个家庭的三个患病胎儿接受了基因诊断和超声诊断，结果显示其无下颌牙胚。羊膜内递送重组融合蛋白，该蛋白由 Ectodysplasin A 的受体结合域和人类 IgG1 的恒定域组成，可恢复汗腺和牙胚的发育 ( Schneider 等人 2018 )。2022 年，启动了宫内酶替代疗法的 I 期临床试验，用于治疗八种溶酶体贮积症 ( NCT04532047 )。病例报告中称，宫内酶替代疗法治疗庞贝氏症是安全有效的 ( Cohen 等人 2022 )。  

佳学基因观点

几项试验表明，从对症治疗到生物治疗再到基因治疗的发展方向。有证据表明，胎儿干预比产后干预具有临床益处。其他试验提供的证据表明，基因治疗越早进行，效果就越好。基因诊断技术与成像方式和生物标志物相结合，最终实现了有效的产前诊断（图 1）。所有这些都支持胎儿基因治疗即将实现的观点，并且推测胎儿基因治疗何时可能发生的评论（包括本文）可能已成为过去。