【佳学基因检测】基因检测RASSF1A 启动子甲基化可以指导前列腺癌风险吗？

肿瘤基因检测与靶向药物选择导读：

前列腺癌 (PCa) 仍然是美国男性癌症相关死亡的最常见原因之一。广泛使用的前列腺特异性抗原 (PSA) 筛查受限于低特异性。其他生物标志物如 RAS 关联结构域家族蛋白 1A (RASSF1A) 启动子甲基化在前列腺癌中的诊断价值以及 RASSF1A 甲基化与病理特征或肿瘤分期之间的关系仍有待确定。因此，对已发表的研究进行了荟萃分析，以了解 RASSF1A 甲基化与前列腺癌之间的关联。在本次调查中，共有 16 项研究涉及 1431 例病例和 565 例对照，采用随机效应模型进行汇总。与对照组相比，前列腺癌病例中 RASSF1A 甲基化的优势比 (OR) 为 14.73，95% CI = 7.58–28.61。分层分析一致显示不同样本类型和甲基化检测方法的风险相似。此外，RASSF1A 甲基化与高 Gleason 评分相关，OR=2.35，95% CI：1.56-3.53。此外，所有纳入研究的汇总特异性为 0.87（95% CI：0.72-0.94），汇总敏感性为 0.76（95% CI：0.55-0.89）。按样本类型分层的每个亚组的特异性保持在 0.84 以上，敏感性也保持在 0.60 以上。这些结果表明 RASSF1A 启动子甲基化将成为 PCa 诊断和治疗的潜在生物标志物。所有纳入研究的汇总特异性为 0.87（95% CI：0.72-0.94），汇总敏感性为 0.76（95% CI：0.55-0.89）。按样本类型分层的每个亚组的特异性保持在 0.84 以上，敏感性也保持在 0.60 以上。这些结果表明 RASSF1A 启动子甲基化将成为 PCa 诊断和治疗的潜在生物标志物。所有纳入研究的汇总特异性为 0.87（95% CI：0.72-0.94），汇总敏感性为 0.76（95% CI：0.55-0.89）。按样本类型分层的每个亚组的特异性保持在 0.84 以上，敏感性也保持在 0.60 以上。这些结果表明 RASSF1A 启动子甲基化将成为 PCa 诊断和治疗的潜在生物标志物。

前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟

介绍

前列腺癌仍然是美国男性癌症相关死亡的最常见原因之一，预计 2013 年将有 29,720 人死亡 。如果通过直肠指检和血清中的前列腺特异性抗原 (PSA) 及早发现前列腺癌是可以治愈的 。PSA 筛查的敏感性为 80%，显着提高了前列腺癌的早期诊断率，但 PSA 筛查的特异性仅为 20%，这可能导致不必要的活检和过度治疗 。因此，诊断和管理因缺乏在疾病早期阶段使用的癌症特异性诊断技术而感到困惑。迫切需要用于明确检测和控制这种癌症的新方法。

分子研究揭示了前列腺癌发展和进展中的重要事件，新生物标志物的出现可能会提高前列腺癌的诊断水平 。基因启动子的异常 DNA 甲基化是癌细胞的特征，并且一些基因以癌症特异性方式发生表观遗传改变。GSTP1 基因启动子甲基化具有多个独立组的广泛特征，并且被发现在前列腺癌中具有诊断价值 。迄今为止，已有一百多个基因被报道为前列腺癌的甲基化靶标，这可能代表了一种监测癌症发生和进展的有前途的方法。最近，基于下一代测序的研究还确定了其他候选基因 。染色体区域 3p21 在多种肿瘤类型中经常丢失（杂合子和纯合子），位于该区域的 RAS 关联域家族蛋白 1A (RASSF1A) 基因是推定的肿瘤抑制基因，与已知小鼠具有高度序列同源性蛋白质 (Nore1) 。研究表明 RASSF1 作为效应器的作用是通过以三磷酸鸟苷依赖的方式结合 RAS 来传播 RAS 的凋亡效应 。RASSF1A 启动子区域内 CpG 岛的高甲基化是表达缺失的主要原因 。在许多实体瘤中，RASSF1A 的甲基化已被确定，其频率在 30% 至 50% 之间变化 。因此，RASSF1A 甲基化影响其抑癌作用，并与不良预后相关 。

尽管在前列腺癌患者中进行了许多个体研究，但 RASSF1A 甲基化状态在前列腺癌中的诊断价值以及 RASSF1A 甲基化与病理特征或肿瘤分期之间的关系仍存在争议。因此，本研究的目的是对RASSF1A甲基化状态在前列腺癌中的预后价值，以及RASSF1A甲基化与病理分期、Gleason评分、PSA水平的关系进行荟萃分析。前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟还评估了体液和组织中 RASSF1A 甲基化对前列腺癌检测的敏感性和特异性。

前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟

材料和方法

研究选择

以前发表的研究前列腺癌中 RASSF1 启动子 DNA 甲基化的文章是通过使用以下关键词对 PubMed 进行电子搜索来确定的；前列腺癌、PCa、RAS 关联结构域家族蛋白 1A 和 RASSF1A。通过已识别文章的参考列表发现了其他研究。本研究仅包括以英文全文发表的研究。最后一次检索是在 2013 年 3 月进行的。

纳入和排除标准

如果研究符合以下标准（1），则选择进行分析：测量以下样品之一中的 DNA 甲基化：血液、血浆、血清、尿液或前列腺组织；(2) 每项研究的受试者由前列腺癌患者和非癌症对照组成；(3) 仅当文章全文为英文时，数​​据才被纳入分析。排除标准是：（1） RASSF1A 甲基化仅在细胞系中进行；(2) 没有可用的原始数据或无法检索任何原始数据；(3)审查论文。

数据采集

对于每项研究，两名独立调查人员提取了以下信息，包括作者的姓氏、出版年份、国家、种族、病例类型和对照。此外，还收集了有关检测方法类型（如 PCR）、癌症临床分期、PSA、Gleason 评分、引物位置、CpG 位置和引物序列的信息。详细信息总结在表格1，表 S2和表 S3。在前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟进行敏感性和特异性分析之前，将病例和对照甲基化数据制成表格。在纳入的研究中，两类被指定为对照：正常对照和活检阴性但患有其他疾病（包括良性前列腺增生（BPH））的患者。只有活检证实的 PCa 和高级别前列腺上皮内瘤变 (HGPIN) 被视为病例。因此，真阳性（TP）样本仅限于在指示病例中具有甲基化的样本，而假阴性（FN）则表明在病例样本中没有甲基化。对对照组中的假阳性 (FP) 和真阴性 (TN) 给出了相同的定义（表 S1）。

表格1

纳入荟萃分析的研究特征。

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BPH，良性前列腺增生；MSP，甲基化特异性 PCR；QMSP，定量实时甲基化特异性 PCR；PYRO，焦磷酸测序；Met，甲基化；Umet，无甲基化；前列腺癌，前列腺癌；HGPIN，高级别上皮内瘤变；强迫症，其他癌症疾病；*对照栏下括号内的数字表示匹配的正常组织；#表示来自没有前列腺癌证据的男性的正常前列腺组织。

Meta分析和统计分析 具有相应 95% CI 的优势比 (OR) 用于检查前列腺癌病例和对照之间 RASSF1A 甲基化频率的差异。同样，还检查了 RASSF1A 甲基化与前列腺癌病理分期、格里森评分和 PSA 水平之间的关联。为了评估研究的异质性，对异质性进行了统计检验。如果研究表明研究是同质的，Q 统计量 P>0.05，则通过固定效应模型计算 OR 的总结，否则，选择随机效应模型。此外，还对样本和方法进行了分层分析，使用meta回归研究异质性来源，并进行了敏感性分析，每次删除荟萃分析中的单个研究以确定单个数据集对整体合并 OR 的影响，以评估稳定性。潜在的发表偏倚通过 log [OR] 的漏斗图对其标准误差 (SE) 进行视觉检查，并通过 Egger 检验测试不对称程度。最后采用修剪和填充的方法得出稳定的结论。该荟萃分析使用软件 STATA 11.0 进行。所有 p 值均基于双边检验，p<0.05 被认为具有统计学意义。最后采用修剪和填充的方法得出稳定的结论。该荟萃分析使用软件 STATA 11.0 进行。所有 p 值均基于双边检验，p<0.05 被认为具有统计学意义。最后采用修剪和填充的方法得出稳定的结论。该荟萃分析使用软件 STATA 11.0 进行。所有 p 值均基于双边检验，p<0.05 被认为具有统计学意义。

使用随机效应模型分析敏感性和特异性，在该分析中，处理了流体和组织亚组。前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟利用汇总接收操作特征 (S-ROC) 曲线来评估阳性结果的阈值定义的变化是否会在研究中产生敏感性和特异性值之间的关联。每项研究对真阳性率和假阳性率的对数总和的对数优势比的线性回归估计使 S-ROC 计算成为可能。当这些数量之间的回归为零时，采用二元数据的标准方法对汇总的敏感性和特异性进行独立分析。在这些情况下，数据在对数优势尺度上进行分析（例如，对于特异性，使用的效应大小为 log(Spec/(1-Spec))。

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结果

研究特点

根据前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟的纳入标准，共有 16 项符合条件的研究，涉及 1431 例病例和 565 例对照，被纳入汇总分析。这些研究的特点总结在表格1. 在 16 项研究中，12 项研究使用了组织样本和 4 项特征体液，例如血液、尿液等。使用甲基化特异性 PCR (MSP)、定量甲基化特异性 PCR (QMSP) 或焦磷酸测序监测甲基化 RASSF1A 水平。所有病例均来自活检证实的 PCa 或 HGPIN，而对照仅限于 BPH、健康受试者或患有泌尿生殖系统癌（膀胱癌）且前列腺健康的患者。11 项研究的样本主要来自高加索人种，而 4 项研究以亚洲人群为特征，一项研究包括来自不同大陆的多个种族的受试者。前列腺癌在所有研究中均得到病理学证实。

RASSF1A 启动子甲基化与 PCa 病例病理分期、Gleason 评分和 PSA 水平之间的关联

在随机效应模型下，与非癌症对照相比，前列腺癌病例中 RASSF1A 甲基化的汇总 OR 为 14.73，95%CI = 7.58–28.61（表 2）。在按样本进行的分层分析中，流体样本（OR = 26.27, 95%CI = 7.79-88.61）和组织（OR = 12.28, 95%CI = 5.86-25.76）中的 RASSF1A 甲基化风险显着增加。通过方法分层分析，MSP（OR 6.75, 95% CI = 3.42-13.22）和 QMSP（OR = 31.50, 95%CI = 10.95-90.62）也发现风险显着增加（图 1A）。前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟还分析了 PCa 病例的病理分期、Gleason 评分和 PSA 水平与 RASSF1A 甲基化之间的关系。七项研究 有足够的信息来进行此分析（表 S2），前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟发现除了 Gleason 评分（OR=2.35, 95%）外，具有适当模型的组之间没有显着关联CI：1.56-3.53，I 2 =32.3%）。详细信息显示在表3.

表 2

RASSF1A 甲基化和前列腺癌风险的分层分析。

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MSP，甲基化特异性 PCR；QMSP，定量实时甲基化特异性 PCR；或，优势比；

CI，置信区间；多项研究；不适用，不适用。

图1：显示 RASSF1A 甲基化与前列腺癌之间关联的森林图。

(A) 16 项研究的森林图表明，通过方法进行分层分析，RASSF1A 甲基化与 PCa 风险相关。(B) 去除 6 项研究的敏感性分析后的森林图显示相同的风险没有异质性 (p = 0.089)。菱形符号表示来自荟萃分析的总体估计及其 CI（置信区间），而其中心位于总体效应估计的值上。菱形宽度描述了整个 CI 的宽度。

表3

RASSF1A 启动子甲基化与 PCa 病例病理分期、Gleason 评分和 PSA 水平之间的关联。

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或，优势比；CI，置信区间；PSA，前列腺特异性抗原；GS格里森分数。

Meta回归结果表明ORs的趋势与甲基化检测方法相关，这占了异质性的一部分（系数=-1.69，p=0.024，调整后的R 2 = 47.41%），但是，其他因素如样本类型 (p=0.525)、发表年份 (p=0.608) 和患者来源 (p=0.847) 无法解释异质性。前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟还进行了敏感性分析，以确定省略一项研究对整体效果的影响，其中六项独立研究被发现引入了一些异质性来源。因此，当前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟排除由于不同类型的病例和对照而可能引入高异质性的六项研究时，前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟观察到异质性降低（p = 0.089），结论稳定（OR = 14.45, 95%CI = 8.35-25.01）（图 1B）。

前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟没有观察到任何发表偏倚（Egger 检验；p = 0.066），并通过实施修剪和填充方法进一步证实了这一观察结果。使用或不使用修剪和填充方法的荟萃分析没有得出不同的结论，表明前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟的结果在统计上是稳健的。Egger 检验提示 RASSF1A 甲基化与病理分期或 Gleason 评分相关性研究不存在发表偏倚（P>0. 05）（表3）。

使用不同类型样品的 RASSF1A 启动子甲基化的特异性和敏感性

所有纳入研究的汇总特异性为 0.87（95% CI：0.72-0.94），汇总敏感性为 0.76（95% CI：0.55-0.89）。对于传统的生物标志物而言，PSA的敏感性各不相同，但特异性普遍较低，约为20%，这表明RASSF1A甲基化检测的特异性远高于PSA检测。异质性的 p 值 <0.001，表明存在显着的异质性。没有发表偏倚的证据（p=0.13）。此外，前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟根据样本类型（流体/组织）将所有样本分为两组。在液体研究（尿液/血液/血浆）中，汇总的敏感性和特异性分别为 0.60（95% CI：0.08-0.96）和 0.93（95% CI：0.75-0.98）。对于组织研究，汇总的敏感性和特异性为 0.79（95% CI：0.64-0.89）和 0.84（95% CI：0.63-0图 2.

图 2：使用 S-ROC 曲线进行 Meta 分析。

SENS：灵敏度，SPEC：特异性，AUC：曲线下面积。

前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟

讨论

前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟的荟萃分析结果表明，当在尿液、血液或组织样本中监测时，前列腺癌中的 RASSF1A 甲基化与癌症风险显着相关。它还与高 Gleason 评分的风险增加有关。RASSF1A 的综合特异性 (0.87) 远高于 PSA 的特异性 (20%)。此外，按样本类型分层的每个亚组的特异性保持在 0.84 以上，RASSF1A 的敏感性也保持在 0.60 以上。这些结果表明 RASSF1A 启动子甲基化将是诊断 PCa 的有价值的生物标志物。

DNA 甲基化是使癌症中的肿瘤抑制基因失活的常见机制 。监测异常甲基化模式有助于检测临床标本（如组织活检或体液）中的肿瘤细胞。RASSF1A是一种推定的抑癌基因，在不同类型人类肿瘤的调控中发挥着重要作用。以前的报告表明，RASSF1A 的遗传变异会影响前列腺癌的易感性，并且发现 RASSF1A 甲基化的频率在患者组中显着高于对照组 。为了进一步确认前列腺癌患者诊断中的 RASSF1A 启动子甲基化状态，前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟对涉及 1431 例病例和 565 例对照的 16 项研究进行了荟萃分析，以得出更精确的关联估计。前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟的结果表明 RASSF1A 甲基化是 PCa 的潜在危险因素，在体液和组织中均检测到。PCa 病例中 RASSF1A 甲基化的频率是对照组的 14.73 倍。此外，由于研究之间病例和对照之间的差异，前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟进行了敏感性分析并删除了选定的研究以使数据更加均匀，并且观察到前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟的结论没有重大变化。重要的是，RASSF1A 基因的频繁甲基化与 Gleason 评分显着相关，

如前所述，PSA 检测具有不同的敏感性和较差的特异性（约 20%）。目前的要求是提供更高特异性而不是敏感性和补充 PSA 测试的测试。有希望的是，前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟的结果表明，RASSF1A 甲基化检测由于其高特异性而有可能补充 PSA 筛查。在这里，前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟相信顺序测试模型将更有帮助，其中 PSA 测试将最初用于识别 PSA 水平升高的患者，然后是 RASSF1A 甲基化测试以增加真实阳性。RASSF1A 检测呈阴性的患者可以观察等待，而结果呈阳性的个体可以推荐进行活检。因此，顺序测试将大大减少仅基于 PSA 测试的不必要的活检建议。

本研究有几个局限性。首先，用于监测基因启动子甲基化的方法的异质性，如 MSP、Q-MSP 和焦磷酸测序。根据所进行的研究，如果能够就标准测试达成共识将是有帮助的。与单独使用 PCR 的方法相比，基于测序的技术通常被认为具有优越的性能。使用下一代测序 (NGS) 检测来监测基因组和表观基因组变化的迅速发展势头必将引领该领域的进步 。可以预见，综合诊断测试的发展将同时测量一组生物标志物的转录物表达和 DNA 甲基化变化，此外还可以识别每个患者的基因异常，例如基因融合和拷贝数变异 。目前的研究与其他研究一起帮助筛选出具有巨大潜力的生物标志物，这些生物标志物在分析通常会产生一长串甲基化区域的 NGS 结果时将受到特别关注。其次，这些研究中使用的不同样本类型（包括血浆、血清、尿液、全血和组织）是异质性的潜在来源。在这里，再次开发具有高灵敏度和特异性的高性能稳健分析可能有助于在不久的将来克服这一问题。

前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟

结论

这项荟萃分析表明，前列腺癌中的 RASSF1A 甲基化与不同研究人群的癌症风险相关。RASSF1A 是一种很有前途的生物标志物，可用于筛查和识别 PCa，尤其是与 PSA 测试相结合以降低不必要的活检率时。基于下一代测序方法的更大样本队列和新测定的未来研究将有助于进一步加强前列腺癌的基因检测的基因与位点收集联盟的观察。

Association between RASSF1A promoter methylation and prostate cancer: a systematic review and meta-analysis.

Pan J, Chen J, Zhang B, Chen X, Huang B, Zhuang J, Mo C, Qiu S.

PLoS One. 2013 Sep 20;8(9):e75283. doi: 10.1371/journal.pone.0075283. eCollection 2013.