【佳学基因检测】非小细胞肺癌的多种基因检测与基因组分析技术对呼吸科肿瘤治疗的影响

肿瘤基因检测与靶向用药导读

在了解驱动非小细胞肺癌 (NSCLC) 肿瘤发生、维持和进展的关键分子和细胞机制方面取得了实质性进展。在过去的十年中，这些发现导致了各种新型药物靶点的发现和新治疗策略的开发。晚期非小细胞肺癌患者的护理标准已经从根据患者的临床病理特征凭经验选择治疗转变为使用基于患者肿瘤分子谱的生物标志物驱动的治疗算法。这种方法目前最好的例证是用一线酪氨酸激酶抑制剂治疗非小细胞肺癌患者，因为他们的癌症在表皮生长因子受体 ( EGFR ) 中具有功能获得性热点突变。) 基因或间变性淋巴瘤激酶 ( ALK) 基因重排。这些基于基因型的靶向治疗代表了向个性化非小细胞肺癌治疗迈出的第一步。通过下一代测序技术在多重基因分型和高通量基因组分析方面的最新技术进步现在提供了从小肿瘤活检中快速全面地询问个体患者的癌症基因组的可能性。这一进展为对分子定义的非小细胞肺癌患者亚群进行分类提供了基础，在这些患者中，越来越多的新型分子靶向治疗药物可以进行临床评估，并且可以发现更多的新型药物靶点。越来越多的执业肿瘤学家面临着确定如何选择、解释和应用这些新的遗传和基因组分析的挑战。这篇综述总结了演变、早期成功、现状、

介绍

无论组织学亚型如何，非小细胞肺癌 (NSCLC) 都是所有癌症中基因组最多样化和最混乱的一种，为预防和治疗策略带来了巨大挑战。然而，这种相同的生物多样性为利用患者间肿瘤异质性提供了许多机会，方法是将非小细胞肺癌分解为各种分子定义的亚组，其中突变和/或异常基因表达驱动癌细胞生长和存活，并且可以作为药物目标。尽管由此产生的从经验到基于机制、分子生物标志物驱动的治疗决策的转变仍处于早期阶段，但新的药物类别已经改变了晚期非小细胞肺癌的管理模式。一个原理验证的例子是识别功能获得性酪氨酸激酶激活表皮生长因子受体 ( EGFR ) 突变作为预测肿瘤反应和对 EGFR 的无进展生存期临床病理学特征的最佳预测生物标志物酪氨酸激酶抑制剂（TKI）。同样，功能获得性酪氨酸激酶激活ALK基因重排是预测对一流 ALK TKI 克唑替尼的肿瘤反应和无进展生存期的有效预测生物标志物。最重要的是，克唑替尼是首批获得美国食品和药物管理局 (FDA) 批准的两种药物之一，同时获得了 FDA 批准的伴随诊断测试，用于选择肿瘤隐藏的罕见非小细胞肺癌患者亚群（2% 至 7%）ALK基因重排。此外，从发现非小细胞肺癌中的致癌ALK基因重排到药物批准的 4 年时间与通常大约 10 年的药物开发过程相比明显缩短。这一里程碑凸显了在为罕见的非小细胞肺癌患者开发一种基于机制的新药物期间及早建立预测性生物标志物测定的重要性，目的是提高 III 期治疗的成功率。理想情况下，正如最近审查并显示在图1，伴随新药相关的预测性生物标志物检测的开发可能与新药开发过程本身平行，因此新药的 III 期试验用于验证生物标志物检测。在此，呼吸科肿瘤精准治疗对基因检测的依赖评估团队对基因分型和基因组检测在非小细胞肺癌中用于治疗决策的临床应用进行简要总结和展望。

图1：改进的药物-生物标志物开发范例：药物-生物标志物开发的结合。数据适应。7

个性化医疗的发展和技术进步

美国国家癌症研究所将个性化医学定义为“一种利用个人基因、蛋白质和环境信息来预防、诊断和治疗疾病的医学形式”。与蛋白质生物标志物相比，癌症遗传生物标志物通常具有更高的可重复性，并且较少受到内在和外部刺激的影响。数十年的癌症研究表明，癌症是由许多基因组异常的积累导致的，这些异常最终控制着肿瘤的发生、维持和进展。虽然遗传学通常是指对单个基因的研究，但基因组学是指研究完整基因及其在个体中的功能。基于分子的个性化癌症治疗的中心假设是，基于肿瘤基因型和基因组谱的治疗决策将改善临床结果，如缓解率、存活率和安全性所衡量的那样。

基于 DNA 的高通量基因组技术的进步极大地加速了个性化癌症医学的发展。 图 2总结了过去三年中这些技术进步的里程碑及其对人类基因组学的影响。第一代 Sanger 测序技术与第二代或下一代测序 (NGS) 技术之间的根本区别在于无需凝胶或聚合物作为筛分分离基质以及无需先验知识的基因组序列。这些高通量技术能够以更快的速度进行核酸（DNA 和 RNA）测序，同时减少错误和每个碱基的成本。NGS的数据输出一直在不断增加，自发明以来每年翻一番还多。例如，2007 年单次测序运行最多可产生约 1 GB 的数据，2011 年可产生约 1 TB 的数据，这在 4 年内增加了近 1000 倍。然而，鉴于癌症基因组中的大量核苷酸，成本仍然很高。这些技术的早期临床应用使个体患者癌症的快速和全面的分子注释成为可能，有助于识别可操作和/或新的药物靶点和治疗方案，以及潜在发病机制的表征。呼吸科肿瘤精准治疗对基因检测的依赖评估团队建议根据所使用的治疗策略将基因分型和基因组分析在肺癌个体化医疗中的作用分为三个阶段（图 3)，这与以下部分讨论的基因和基因组测试的技术进步平行。

图 2:测序技术和人类基因组学的进展。

图 3:个性化医疗中的基因分型和基因组分析：癌症分子诊断和治疗的科学革命。CNV，拷贝数变异；FFPE，福尔马林固定石蜡包埋；FISH，荧光原位杂交；IHC，免疫组化；RT-PCR、逆转录聚合酶链反应；SNP，单核苷酸多态性。

基于基因型的分子生物标志物

基于单基因的生物标志物的临床应用已被证明在指导非小细胞肺癌中分子靶向药物的选择方面是成功的。 EGFR TKI 厄洛替尼和吉非替尼是 2004 年批准用于治疗晚期非小细胞肺癌的第一类分子靶向药物。虽然这些药物最初被批准用于未经选择的非小细胞肺癌患者，但随后出现了增益-功能性酪氨酸激酶激活EGFR突变被证明最能预测对 EGFR TKI 的反应。2011 年 8 月，FDA 加速批准了一流的 ALK 抑制剂克唑替尼用于治疗 ALK 阳性晚期 NSCLC。随后，国家综合癌症网络和美国临床肿瘤学会指南均建议对所有含有腺癌成分的非小细胞肺癌进行EGFR突变和ALK基因重排检测，无论其组织学分级或主要组织学亚型如何。EGFR 突变和ALK检测不推荐用于纯鳞状细胞癌、纯小细胞癌或纯神经内分泌癌。最近的基因分型研究表明，腺癌和鳞状细胞癌中存在不同的遗传异常，为开发针对特定分子亚群的新型分子靶向和生物标志物驱动的治疗策略提供了机会（图 4;表格1）。

图 4:非小细胞肺癌 (NSCLC) 亚型从组织学到分子的演变。数据适应。EGFR，表皮生长因子受体；HER2，人表皮生长因子受体2；MAP2K1，丝裂原活化蛋白激酶激酶 1。

表1：癌基因突变预测非小细胞肺癌患者对当前靶向治疗的反应或耐药性的可能性

缩写：EGFR，表皮生长因子受体；NSCLC，非小细胞肺癌；TKI，酪氨酸激酶抑制剂。

*常见突变（外显子 19 缺失、L858R、L861Q 和 G719A/C/S）与对 EGFR TKI 的反应相关；T790M 和外显子 20 插入等罕见突变与对 TKI 的耐药性有关。

† KRAS突变和 ALK 2p23 重排也可以预测耐药性。预测耐药时应考虑替代疗法。

目前，EGFR突变检测可以从几张福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 标本载玻片上从肿瘤细胞中提取的纳克基因组 DNA 中进行，一些实验室的周转时间为 5 到 10 天。在过去的几年里，这些基因检测的检测开发和分析验证和临床验证的监管有了显着改善。今天，临床分子病理学实验室可以在临床实验室改进法案认证的学术或商业实验室中使用 FDA 批准的试剂盒和设备进行这些测试。最近，三个对肺癌诊断和管理感兴趣的专业组织——美国病理学家协会、国际肺癌研究协会和分子病理学协会——的代表召开会议，审查已发表的数据并制定肺癌分子检测的EGFR突变和ALK基因排列检测的循证指南建议。该报告草案目前可在线获取以征询公众意见。这些分子测试在世界范围内被越来越多地使用。值得注意的是法国政府资助的计划，该计划于 2009 年启动，旨在为包括非小细胞肺癌在内的多种癌症患者提供全国范围的分子检测。对于 NSCLC，努力从检测EGFR突变开始。2010 年，超过 17,000 名法国患者在公立医院的 28 个实验室进行了EGFR突变检测，周转时间为 13 天。

已知热点癌基因突变的多重基因分型

尽管分子靶向药物的里程碑式研究主要集中在单个或少量基因突变上，但越来越需要开发临床适用的方法，这些方法可以同时确定许多感兴趣基因的突变或表达状态，并使用小肿瘤来确定样品。多重聚合酶链式反应 (PCR) 定义为在单个反应容器中同时扩增至少两个 DNA 或 cDNA 靶标。Sequenom (Sequenom, San Diego, CA) 和 SNaPShot (Applied Biosystems, Foster City, CA) 平台都使用多重 PCR 从源自 FFPE 肿瘤标本的基因组 DNA 中鉴定肺癌中潜在的可操作分子靶标。这些检测方法正在癌症研究界广泛使用，并显示出临床应用前景。表 2比较了 Sequenom 和 SNaPShot 面板中包含的热点突变和癌基因列表以及相应的批准和/或实验药物。值得注意的是，这些多重基因组测试仅检测选定的已知热点突变和癌基因的表达，并没有发现新的或额外的药物靶点的能力。易于识别的致癌基因构成了大部分成分，反映了特定氨基酸（即热点）的精确变化足以进行致癌激活和致癌添加。相比之下，肿瘤抑制基因的失活可能涉及基因座广泛区域的缺失或点突变，使分析更具挑战性。此外，目前还没有公认的治疗策略来恢复或修复肿瘤抑制因子的功能。因此，

表 2:Sequenom 和 SNaPShot 面板中热点突变和癌基因及其相应批准和/或实验药物的比较

缩写：TKI，酪氨酸激酶抑制剂。

*批准用于其他肿瘤类型。

†通过荧光原位杂交检测。

‡通过大小测定进行检测。

• 此突变导致过早终止密码子。

Sequenom 癌基因型突变分析

Sequenom 平台是一个基于阵列的系统，将 PCR 与基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法相结合，用于快速多重核酸分析。Sequenom OncoCarta V1.0 试剂盒使用多重 PCR 扩增每个样本至少 500 ng 肿瘤 DNA（即，每个多重反应 20 ng DNA），在通常与癌症相关的 19 个不同基因中总共有 238 个致癌基因的体细胞突变（表 2）。PCR 反应经过纯化，并在 Sequenom MassArray 上进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析。对特定的扩增子（和突变）进行分析和定量。该测定可以使用来自新鲜、冷冻或 FFPE 样品和/或细胞系的肿瘤样品。它可以检测和量化至少 10% 的突变阳性细胞的突变频率。Sequenom 癌基因突变基因分型平台的主要优势包括市售的试剂盒，具有优化每个多重 PCR 反应的技术支持、易于操作和易于解释的数据报告表。周转时间可能与基于单基因的检测相似。缺点包括需要购买Sequenom设备和需要供应商'

SNaPshot 癌基因型突变分析

Applied Biosystems 的 SNaPshot 平台由多重 PCR 和单碱基延伸反应组成，可生成荧光标记的探针，用于检测 8 至 14 个关键癌症基因中的 50 多个热点突变位点。不同实验室之间的基因列表可能略有不同。在一个碱基延伸反应中，最多可以检测来自不同扩增子的 10 个单核苷酸多态性。与标准测序相比，它提高了灵敏度（大约 10%），允许检测每个试管中的单碱基对差异。然后使用毛细管电泳在主要学术机构普遍提供的几种 ABI 遗传分析仪（应用生物系统）模型上解析和分析 SNaPshot 产品。与 Sequenom 平台相比，SNaPShot 平台中包含的热点突变和癌基因列表缩小到在非小细胞肺癌中检测到的高流行基因异常（表 2）。尽管 SNaPshot 比传统的基于 DNA 的测试（通常只关注EGFR和KRAS测序）改进了分子测试，但它是劳动密集型的，通常需要 2 到 3 周的周转时间。与 Sequenom 平台相比，它还需要更多的基因组 DNA 进行测试。

已知热点癌基因突变的多重基因分型的临床应用

许多独立机构和合作团体已开始将基因组分析应用于非小细胞肺癌患者的治疗决策。肺癌突变联盟在 14 个学术中心（ClinicalTrials.gov 标识符：NCT01014286）之间发起了一项美国协作基因分型工作，目标是使用如前所述的 SNapShot 平台对 1000 名肺腺癌患者的 10 个驱动突变进行基因分型。使用 FDA 批准的用于ALK基因重排和MET扩增的荧光原位杂交分析。在一份初步报告中，在最初测试的 516 个肿瘤中，有 54% 存在至少一个可操作的驱动突变，包括KRAS突变（22%）、EGFR突变（17%）和EML4-ALK重排（7%）。几乎所有这些突变（97%）对于测试的遗传异常都是相互排斥的。与之前的单一机构经验一致，基因分型结果改变了数据集中 20% 至 40% 的非小细胞肺癌患者的治疗，该数据集中用于评估新型分子靶向药物的安全性和有效性的几个早期临床试验之一针对个体癌基因突变。将来，NSCLC 肿瘤的综合基因注释可能会附加到 Sequenom 和 SNaPshot 面板的基因和突变列表中。

高通量全基因组无偏NGS

NGS 技术为 DNA、mRNA、转录因子区域、miRNA、染色质结构和 DNA 甲基化模式的全基因组表征提供了新的快速方法。它们包括用于全基因组、全外显子组、全转录组（RNA 测序）和全表观基因组分析的几个测序平台，使用“合成测序，通过可逆终止核苷酸添加和检测掺入的碱基”不需要凝胶和基因组序列的先验知识。每个测序平台都有其独特的功能，如果价格合理，这些平台可用于相互补充单个肿瘤的癌症基因组数据。Illumina（加利福尼亚州圣地亚哥）、454 Life Sciences（康涅狄格州布兰福德；罗氏应用科学的一部分）、Helicos BioSciences（马萨诸塞州剑桥）和 Applied Biosystems 有几个 NGS 平台。它们都产生了大量低成本、大容量的测序数据。Illumina-Solexa NGS（RNA测序）技术（Illumina）于2006年首次商业化，Illunima-Solexa基因组分析仪是目前最常用的测序仪。根据所需的测序分辨率深度，大规模并行测序需要 0.1 到 3 μg 的核酸来生成 DNA、RNA 和 microRNA 序列，用于点突变、单核苷酸多态性、拷贝数变异，重要的是新的融合基因，它们是无偏的（未引物的），更充分地代表了整个转录组。NGS 技术的一大优势在于其覆盖率（通常指与样本 DNA 中的每个碱基对齐的测序读数的平均数量）是高度可调的。例如，以 20 倍覆盖率测序的全基因组意味着，平均而言，基因组中的每个碱基都被 20 次测序读数覆盖，这可以检测到频率至少为 5% 的碱基变化；100倍覆盖率的全基因组测序意味着基因组中的每个碱基平均被100次测序reads覆盖，可以检测到至少1%的低频碱基变化。NGS 还可以在一次运行中多路复用以对五个以上的人类基因组进行测序。几个新的NGS平台，

正如最近 2012 年美国临床肿瘤学会年会报告的那样，NGS 技术已迅速应用于几乎所有肿瘤类型的临床环境中。它们被用作了解肿瘤分子机制、发现新药物靶点和筛选临床试验候选患者的研究工具。目前，生成测序数据大约需要 1 周时间，数据分析至少需要 2 周时间。所有三项 NGS 检测所需的试剂成本约为 3,500 至 5,000 美元，尽管价格可能会进一步下降。一个主要挑战是生成的数据的复杂性以及需要强大的生物信息学工具来充分了解许多同时识别的基因组异常中的每一个的功能影响。最好将这种情况描述为“1000 美元的基因组测试和 100,000 美元的基因组分析”。已经探索了几种靶向 NGS 方法，通过缩小序列覆盖范围和多路复用多样本分析来简化数据提取（例如，使用靶向、大规模并行测序方法仅检测癌症相关基因中的肿瘤基因组变化，或关注仅在酪氨酸激酶融合基因上）。这些方法在大规模研究中的可重复性及其临床效用的验证仍有待评估。

在非小细胞肺癌和其他肿瘤中应用 NGS 技术的早期经验表明，平均而言，每个肿瘤样本可鉴定出 100 到 200 多个基因组异常，这高于在遗传性疾病中观察到的 50 到 100 个变异。除了已知的非小细胞肺癌中的热点致癌突变或基因重排，NGS 还发现了以前在其他癌症类型中已知的遗传异常，并在不了解其生物学功能的情况下发现了许多新的遗传异常。基于通路的综合系统生物学方法已被用于在已知和新出现的癌症特征的背景下解释数据。即使对于已知在其他癌症类型中具有预后和/或预测价值的基因改变，在许多情况下，它们在非小细胞肺癌中的作用仍有待在严格的临床试验环境中确定。新发现的基因异常可以作为潜在的药物靶点和预测性生物标志物，以及影响药物代谢和癌症预后的基因变异。这些新的致癌分子生物标志物越来越多地在罕见的患者亚群中被发现。从乘客异常中筛选出驾驶员基因组异常以进行针对性治疗至关重要。理想情况下，需要前瞻性、同步的多个生物标志物驱动的治疗试验来评估晚期非小细胞肺癌患者个体化癌症治疗的临床可行性和有效性。EGFR突变。

基因分型和基因组检测临床应用的挑战和机遇

将最先进的癌症基因组学转化为常规临床应用需要新的转化研究平台来选择和验证临床相关的药物靶点和相关的生物标志物测定。此外，当这些检测方法整合到临床实践中时，它们必须对执业临床医生广泛可用，适用于小肿瘤活检，并且患者负担得起，并且将测试信息返回给治疗医生的周转时间必须很短，通常定义为最多 2 周。目前，当务之急是开发系统的测试算法，以确定基因组定义的非小细胞肺癌患者亚群，他们可以通过商业或临床试验获得有效的药物治疗。

首先，基于患者间肿瘤异质性，NSCLC 被公认为是多样化的。最近，已经观察到与患者体内肿瘤异质性相关的额外复杂性，特别是与从原发性肿瘤到转移性病变的体细胞突变的克隆进化以及不同肿瘤部位对分子靶向药物治疗的混合肿瘤反应相关。这种现象在获得性耐药性和生物标志物检测的发展中所起的作用很可能因个体患者而异，或者可能因同一患者的一个转移部位而异。

其次，疾病过程中癌症基因组内的动态变化现在被认为是一个额外的挑战，因为肿瘤基因组成可能在疾病进展期间或响应治疗时发生重大变化。目前的经验表明，尽管大多数驱动突变在耐药性肿瘤中仍然存在，但可能会出现其他可操作的遗传/基因组异常。此外，EGFR突变、ALK基因重排和KRAS突变很少在初治非小细胞肺癌肿瘤中共存，但它们可以在来自难治性非小细胞肺癌患者的重新活检肿瘤标本中共存。这种现象的临床意义仍有待确定。然而，它确实支持获取连续活检标本，以评估疾病过程中组织形态学和癌症基因组学的实时变化，这对肺癌患者来说是可行和安全的。

第三，肿瘤组织的数量和质量对于所有基因和基因组检测都至关重要。一些专业和监管机构已经制定了指导方针来解决监管和质量控制要求，以确保可以跟踪和控制样品收集和处理的分析前变量。需要改进监管系统以确保在人类中进行基因和基因组检测的质量。由于癌症是一种全球健康危害，因此更有效监督的一个关键因素是允许国内和全球监管机构之间进行更多合作。

第四，尽管全基因组测序在个性化癌症治疗方面具有前所未有的潜力，但当前的挑战是如何分析大量基因组数据，用于临床相关的药物靶点和药物基因组变异。如前一节所述，正在积极探索缩小特定癌症基因的测序覆盖率和每个 NGS 反应的多个样本的多重分析，作为提高临床适用性的策略。仅在 2011 年，基因组技术的几项显着进步提高了呼吸科肿瘤精准治疗对基因检测的依赖评估团队使用新技术编辑和分析基因组的能力，例如基因组靶向编辑、搜索和替换编辑技术、使用短读长映射结构变异和多重自动化基因组工程。值得注意的是，多重自动化基因组工程是一种使用合成寡核苷酸的体内方法，能够以高效率和特异性快速生成突变体，并且可以在基因组规模上实施。

最后但同样重要的是，在非小细胞肺癌中进行基因分型和基因组测试的临床实施需要多学科医疗保健专业人员之间的密切合作，包括但不限于外科医生、肺科医生、放射科医生、病理学家、转化科学家、医学肿瘤学家、保险公司和监管机构机构。让 NSCLC（个体化癌症治疗的主要目标）患者参与进来也非常重要，以帮助他们了解分子检测日益增长的重要性，并激励他们以适当的方式参与这一过程。

总结和展望

总之，检测功能获得性酪氨酸激酶激活EGFR突变和ALK自 2009 年以来，通过现代分子技术对非小细胞肺癌肿瘤（主要是肺腺癌）进行基因重排，已在常规临床实践中分别用于选择不同的非小细胞肺癌患者亚群进行 EGFR TKI 一线治疗和 2011 年以来用于 ALK TKI 的一线治疗。许多额外的分子靶向疗法正在开发用于小部分（< 5%）非小细胞肺癌患者。与此同时，预测性生物标志物的开发和验证正被纳入这些药物临床试验的早期阶段。这种药物开发过程和临床护理的新范式变化同时为抗击肺癌的所有利益相关者创造了新的希望、许多机遇和许多挑战。目前，一些用于可操作热点癌基因突变或基因扩增/重排的多重基因分型平台正在研究环境中进行评估，并取得了可喜的结果，并且正在肿瘤学实践中广泛应用于临床。然而，广泛的基因分型方法是否会改善非小细胞肺癌患者的临床结果，还有待通过严格的前瞻性临床评估来证明。展望未来，使用可扩展和多重 NGS 技术对单个非小细胞肺癌肿瘤进行综合的全基因组分子注释为推进个性化癌症治疗带来了巨大希望，其目标是最大限度地提高疗效并最大限度地减少毒性。将癌症基因组学的发现转化为临床护理改进的最大挑战是了解基因组畸变在个体患者肺癌随时间演变的背景下的生物学相关性。尽管仍有许多障碍需要克服，但基因组技术和药物开发的最新进展以及由此产生的基因组信息和新药的大量涌现正在使基于分子的个性化肺癌治疗不再只是梦想。

Genotyping and genomic profiling of non-small-cell lung cancer: implications for current and future therapies.

Li T, Kung HJ, Mack PC, Gandara DR.

J Clin Oncol. 2013 Mar 10;31(8):1039-49. doi: 10.1200/JCO.2012.45.3753. Epub 2013 Feb 11.