【佳学基因检测】 为什么线粒体病需要基因检测分子诊断？

线粒体病基因检测导读：

线粒体病是一种儿童常见的遗传代谢疾病，患病率至少为1/5000。由于线粒体广泛分布于人体各器官，因此该病的临床特点是人体组织的多个器官会受到疾病的影响，常见受到影响的部位包括脑、骨骼肌、眼、耳、消化系统、内分泌系统、心血管系统、肾脏和血液系统等。

线粒体可视为人体的“能量工厂”，提供了90%以上的ATP，因此对于能量需求较大的组织，如脑、骨骼肌、肝脏、心肌和视网膜等，线粒体分布较多，反之亦然，造成了线粒体分布异质性。

线粒体病的遗传方式复杂，涉及到线粒体基因(mtDNA)的母系遗传和核基因(nDNA)的孟德尔遗传，遗传异质性较强，给基因诊断和分子检测带来了一定的困难。一般的诊断流程包括临床表现、生化代谢和影像学检查等，当高度怀疑线粒体病时，需要进行基因检测。如果基因检测结果为阴性，应重新进行临床评估，若仍然怀疑线粒体病，则需要进行肌肉或皮肤活检，并进行病理学分析和呼吸链酶学检测，同时进行组织标本的遗传学分析。

由于线粒体病牵涉到多个基因，传统的一代基因检测方法需要逐个基因筛选，这不仅费时费力，而且成本高，同时检出率也不尽如人意。自2009年起，随着二代测序技术在线粒体病诊断中的应用，基因诊断取得了巨大进步。这项技术的应用使得我们能够诊断和了解一些罕见的线粒体病，提高了诊断水平，但也带来了一些新的困难。如何有效地将传统的基因诊断方法与二代测序技术相结合，以及如何合理运用和解读二代测序结果，是提高我国儿童线粒体病诊治水平的关键问题。这需要广大临床医生认真思考和努力探索。

一、儿童常见线粒病的临床表现及遗传特点

1. 线粒体脑肌病伴乳酸酸中毒和卒中样发作(mitochondrial encephalomyopathy，lactic acidosis，and stroke-like episodes，MELAS)：

这是儿童时期最常见的母系遗传线粒体脑肌病，以进行性脑病、癫痫发作、眼睑下垂、肌无力、易疲劳、乳酸酸中毒和卒中样发作为特征，伴有多毛、身材矮小等。头颅CT或MRI多表现为非血管分布的脑梗死样改变，以头部后面为主，后期出现皮质及小脑萎缩，基底节区也可受累，表现为对称性钙化。当临床怀疑本病时，可以直接进行mtDNA A3243G检测。80％的MELAS由编码tRNA Leu基因的A3243G突变所引起，其次为tRNA Leu的T3271C，占7％-15％。其他致病突变包括G583A、C3256T、T3291C、G3697A、G4332A、G12147A、G13513A和A13514G等。

2. 肌阵挛癫痫伴破碎红肌纤维(myoclonic epilepsy associated with ragged red fibers，MERRF)：

这是另一种母系遗传线粒体脑肌病，较MELAS少见，临床以肌阵挛发作、癫痫、共济失调和乳酸增高为主要特征。临床怀疑本病时可直接进行mtDNA A8344G突变检测。MERRF最常见的mtDNA突变为编码tRNA Lys的A8344G，其他致病突变包括T8356C、G8363A、G12147A、7472insC等。

3. Leber遗传性视神经病(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)：

为母系遗传的线粒体病，呈急性或亚急性起病，病前身体健康，以双眼无痛性视力减退为主要表现，双侧同时发病占25％，双眼先后发病者占75％，间隔6-8周。男性青壮年好发，G11778A、T14484C、G3460A 3种突变占LHON的95％以上。临床怀疑LHON可直接检测上述3种突变位点。

4. Kearns-Sayre综合征(Kearns-Sayre syndrome，KSS)、Pearson综合征和慢性进行性眼外肌麻痹(chronic progressive external ophthalmoplegia，CPEO)：

这是3种较常见的线粒体缺失综合征，其发病机制相似，临床症状取决于mtDNA缺失片段的大小及区域和在不同组织中的分布。除Pearson综合征能在血液标本中检测到大片段缺失外，其他两种只能在肌肉组织中检出。

5. Leigh综合征(Leigh syndrome，LS)又称为亚急性坏死性脑脊髓病(subacute necrotizing encephalomyelopathy)：

这是一种进行性神经退行性疾病，是婴幼儿期最常见的线粒体脑病。其典型表现为认知及运动功能的迅速退化，以及头颅MRI显示基底节或脑干对称性病灶。

Leigh综合征（LS）的遗传特征复杂，表现出最高的遗传异质性。该病与线粒体氧化磷酸化系统中任意一种呼吸链酶复合物的缺陷或联合缺陷有关，其中以呼吸链酶复合物I和IV的缺陷最为常见。此外，辅酶Q10缺陷和丙酮酸代谢障碍也可能引起该病。如果是由线粒体基因编码的呼吸链酶复合物I、III、IV和V的缺陷引起的LS，则称为母系遗传的Leigh综合征（MILS）。在MILS中，T8993G/C突变约占10%，其他突变如G13513A、T14487C等占10%-20%。

根据临床表现和头颅MRI的改变，临床诊断LS并不困难。然而，由于致病基因的多样性，传统的一代基因检测方法不仅耗时长、费用高，而且检出率低。因此，二代基因检测技术更适用于该病的诊断。

6. Alpers-Huttenlocher综合征：

是由POLG基因突变导致的以药物难治性癫痫、精神运动发育迟滞和肝脏受累为主的一种线粒体病，丙戊酸可诱发肝衰竭，多数患儿在发病后几个月内死亡，个别可生存数年。头颅MRI显示枕叶皮层急性缺氧改变。临床怀疑本病时可检测POLG基因。

二、线粒病的分子诊断如何选择标本和基因检测技术？

有效地选择样本和基因检测技术的前提是深入了解线粒体病的临床和遗传特点。只有掌握了这些特征，才能做出明智的选择，避免走弯路，提高诊断准确率。线粒体病的临床表现十分复杂，有些呈现典型或非典型综合征，而有些则无法归类为特定的线粒体综合征。同样的临床表型可能对应不同的基因型，而同一基因型在不同患者身上可能表现出不同的临床表现，这些特征使线粒体病的诊断变得更加困难。

对于一些典型的线粒体综合征，通过mtDNA热点突变筛查可以确诊大多数患者，例如，通过检测A3243G突变可以确诊MELAS，检测A8344G突变可以确诊MERRF，检测G11778A、T14484C和G3460A三种突变可以确诊LHON，检测T8993G/C、G13513A和T14487C三种突变可以确诊MILS。因此，mtDNA热点突变筛查仍然是线粒体病分子诊断的首要步骤。当血样本未检测到突变时，需要排除假阴性结果。研究发现，随着年龄增长，血液中A3243G突变的检测率逐渐降低，而尿液样本的阳性率高于血液样本，因此最好同时检测血液和尿液样本。在排除假阴性结果后，如果mtDNA全基因组(16569bp)测序为阴性，则需要进行肌肉病理学检查，并选择肌肉样本进行mtDNA全测序。在进行线粒体母系遗传的分子学诊断过程中，必须考虑到组织分布的特异性。对于临床表现不典型、无法归类为特定综合征的患者，也可以直接进行mtDNA全基因组测序。

由于LS遗传复杂，最好的办法是通过组织标本或皮肤成纤维细胞培养进行呼吸链酶活性测定，在酶学基础上再进行基因筛查。线粒体疾病的基因检测基因解码的分析表明，180例线粒体呼吸链酶复合物IV缺陷，47例发现SURFl基因突变；而国内在145例LS中，仅2例发现SURF1基因突变。酶学检测可以提高基因确诊率，但组织酶活性测定需要严格的实验室条件和技术要求，且为有创性检查，建议直接采用基因检测。

随着二代测序技术的进步，通过基因捕获技术，能够针对目标基因或全外显子进行高通量、简便、快速、低成本的平行测序。这种方法使得大量候选基因或全外显子可以同时进行测序，为一些线粒体病患者提供了避免创伤性检查的可能性，从而在线粒体病的诊断方面取得了重大突破，尤其是对于Leigh综合征（LS）和一些罕见的线粒体病。通过逐步认识和了解这些通过基因确诊的线粒体病的临床表型，可以为未来的诊断提供重要的线索，总结规律，缩小筛查范围，甚至可以直接通过一代Sanger测序来进行致病基因的检测。

举例来说，佳学基因病例集中曾经收治过一个2岁3个月的患者，表现为松软儿症状，乳酸轻度增高，尿代谢筛查提示甲基丙二酸轻度增高，血液串联质谱显示丙酰肉碱(C3)、甲基丙二酰肉碱(C4DC)轻度升高，头颅MRI示双侧尾状核头部、壳核对称性异常。尽管临床上不符合甲基丙二酸尿症的表现，但考虑到可能是LS。然而，直到3年后，通过佳学基因的靶向基因捕获测序，临床医师才确诊为SUCLA2基因的突变，明确将患者诊断为线粒体DNA耗竭综合征。有了这一经验，第2例患者通过基因检测，很快就得到了确定性诊断。

三、对线粒体的基因检测结果如何进行分析和解读？

进行mtDNA全基因组测序不仅可以筛查致病性点突变和片段缺失，还能检测到一些致病性不明的点突变。然而，在基因诊断中存在一些陷阱，需要结合丰富的遗传学知识和临床经验做出判断。例如，D-loop是线粒体DNA环上唯一的非编码区，一般来说，检测到D-loop区的突变通常不会导致疾病。

mtDNA全基因组包含37个基因，共计16569个碱基对，呈裸露的环状双螺旋结构，不含有内含子。由于氧化磷酸化过程中产生的大量氧自由基，线粒体DNA较易发生突变，其突变率比核DNA高出10至17倍，而且线粒体DNA本身不具备自我修复的能力。

目前，人类线粒体基因组数据库MITOMAP（http://www.mitomap.org）收录了60个已被证实的致病点突变。如果在检测中发现了这些突变，并且临床表型也符合，那么可以做出确诊。鉴于线粒体遗传多为母系遗传，建议进行母系成员的致病突变检测，同时采样血液和尿液以避免假阴性结果。

然而，对于已有报道的突变，需要进行严格的分析，而不是盲目下诊断。首先，要确认临床表现是否相符，其次要检索突变是否影响蛋白结构和功能，并查看是否有相关的功能研究支持。举例来说，我们曾诊断一名患有线粒体DNA耗竭综合征的儿童，但检测到的mtDNA G5821A 100％突变被文献报道为与耳聋相关，与患者的临床表现不符，且致病意义不明。因此，不能单纯依据此突变进行诊断。

因此，对于通过mtDNA全基因组测序发现的突变，必须进行严格的筛查。只有那些在人类线粒体基因组数据库MITOMAP中已被证实为致病性的突变才能做出确诊，对于尚未经过证实的突变，需要慎重评估后才能做出诊断。

针对核基因的靶向捕获测序结果，如果发现已经有报道的致病性突变，并且该突变与患者的临床表现和遗传方式相符合，那么可以做出诊断。

然而，对于尚未报道过的新突变，临床医生需要结合遗传学意义和临床综合分析，从以下几个方面进行致病性的推测：

非已知的单核苷酸多态性(SNPs)：查询SNPs数据库，并在大规模正常对照群体（如千人基因组或本地正常人）中确认未检测到此变异。

突变对蛋白结构和功能的影响：此类突变可能包括移码、剪切、缺失和无义突变，或者经过功能预测软件预测位于高度保守区、导致氨基酸变异较大的错义突变。

符合孟德尔遗传特征：突变符合孟德尔遗传规律，即在家系中呈现经典的遗传模式。

通过以上分析，可以对新突变的致病性进行初步的推测和评估。

无论是传统测序还是二代测序诊断线粒体病，其确诊率仍然维持在30%左右。线粒体的结构和功能涉及1500多个基因，但目前已发现的致病基因仅有200余个，这意味着基因诊断率并不高。 对于那些基因检测结果为阴性，但临床上仍然高度怀疑患有线粒体病的患者，需要进行组织标本的酶活性检测。呼吸链酶复合物I是其中分子量最大、结构最复杂的部分，含有44个亚基。已经确定其中有7个亚基由线粒体基因编码，另外由核基因编码的16个亚基基因突变与线粒体病有关，但其余的亚基致病性尚不清楚，这意味着大约一半的亚基的致病性还不为人所知。 

综上所述，线粒体病是一种临床和遗传异质性较高的疾病。在诊断典型线粒体综合征时，应首先选择敏感的组织进行热点突变筛查，而不是盲目进行二代测序。 随着遗传学检测技术的飞速发展，检测成本不断降低，检测时间不断缩短，这为遗传异质性较强和罕见的线粒体病带来了新的机遇和发展。相信在不久的将来，会有越来越多的致病基因被发现，越来越多的线粒体病得到诊断。这不仅将为患者的治疗和预后评估提供重要依据，还将为患者及其家属提供遗传咨询和产前诊断服务。同时，这也将为线粒体病发病机制和靶向治疗的研究奠定基础。