【佳学基因检测】 什么是PCR和qPCR？

引言 | PCR的发现

PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛使用的生物技术，由美国生物学家凯里·穆利斯（Kary Mullis）于1983年首次发现。这项技术的发明对分子生物学和基因组学产生了深远的影响，为研究和医学领域带来了革命性的进步。

什么是引物？

引物（primer）是PCR反应中不可或缺的短链DNA片段。它们的作用是为DNA聚合酶提供一个起始点，指导DNA的复制过程。每个PCR反应需要两个引物，一个针对目标DNA的前向引物（forward primer），另一个是反向引物（reverse primer）。

PCR中的DNA扩增

PCR技术的核心是扩增特定的DNA片段。这个过程包括三个主要步骤：

1. 变性（Denaturation）：在高温下，双链DNA会被分开，形成单链DNA。
2. 退火（Annealing）：温度降低，引物会与目标DNA序列结合。
3. 延伸（Extension）：DNA聚合酶在引物的帮助下，沿着单链DNA合成新的DNA链，扩增目标片段。

这些步骤会在一个温控的设备中反复进行，通常需要几十个循环，以使目标DNA片段得到大量复制。

琼脂糖凝胶可视化扩增的DNA

PCR扩增后的DNA片段可以通过琼脂糖凝胶电泳技术进行可视化。将样品加载到凝胶中，并施加电流，DNA片段会根据大小不同而迁移。通过染色剂可以看到DNA带，帮助确定PCR是否成功。

Thermus aquaticus（Taq）聚合酶的发现

PCR技术的一个关键进展是Taq聚合酶的发现。Taq聚合酶来源于一种耐高温的细菌——嗜热菌（Thermus aquaticus）。它可以在高温下稳定工作，使得PCR过程中的高温变性步骤变得可行。

第一个热循环仪

PCR的实现离不开热循环仪（thermal cycler），它可以自动控制温度的变化，以支持PCR过程中的不同步骤。第一个商业化的热循环仪是1986年推出的，它使得PCR技术得以广泛应用于实验室。

实时PCR（qPCR）的发明 | 探针

实时PCR（qPCR）是一种在PCR扩增过程中实时监测DNA数量的技术。与传统PCR不同，qPCR可以在每一个扩增周期中测量DNA的量。此技术使用荧光探针或染料来监测DNA的扩增过程，这使得研究人员能够实时跟踪反应进程。

qPCR扩增图基本概念

qPCR的扩增图展示了DNA量随循环次数的变化。通过观察这些变化，研究人员可以获取关于目标DNA量的定量信息。这种图形显示了每个周期中荧光信号的增加情况，从而帮助确定样品中的DNA浓度。

循环阈值（Ct）值

循环阈值（Ct）值是qPCR中一个重要的参数，它表示在PCR反应中检测到目标DNA的周期数。Ct值越低，表示初始样品中的DNA量越多。Ct值的准确测定可以帮助定量分析样品中的DNA含量。

DNA定量的标准曲线

为了准确量化DNA，qPCR实验通常使用标准曲线。标准曲线是通过测量已知浓度的DNA样品的Ct值绘制而成的。通过将样品的Ct值与标准曲线进行比较，可以确定样品中DNA的具体浓度。

多重PCR | 在一个管中检测多个目标

多重PCR是一种同时扩增多个目标DNA片段的技术。通过使用多个引物和探针，研究人员可以在一个反应管中检测和分析多个目标，从而提高实验效率和减少样品消耗。

PCR和qPCR的应用

PCR和qPCR广泛应用于许多领域，包括医学诊断、遗传研究、法医学等。特别是qPCR在病毒检测、基因表达分析和疾病监测中发挥了重要作用。

使用qPCR检测呼吸道病毒

在呼吸道病毒检测中，qPCR技术被广泛用于检测和定量病毒RNA，例如新型冠状病毒（SARS-CoV-2）。通过高灵敏度的qPCR检测，能够快速准确地识别感染者，辅助疾病控制和防疫工作。

Ct值在COVID-19接触者追踪中的作用

在COVID-19的接触者追踪中，Ct值被用来评估感染者体内病毒的量。这可以帮助确定感染者的传染性以及隔离措施的有效性，从而更好地控制疫情传播。

总结

PCR和qPCR技术是现代生物学研究和医学诊断中的重要工具。PCR用于扩增DNA，而qPCR则能够实时监测和定量DNA。通过这些技术，科学家和医生可以获得宝贵的遗传信息，进行精确的诊断和研究，推动科学和医疗领域的发展。