【佳学基因检测】Sanger测序与CMA在肾脏疾病诊断检测中的应用

诊断性基因检测旨在确定导致个体患者疾病的突变，但人类基因组中丰富的变异使这项任务变得困难。典型的人类基因组包含约30亿个DNA核苷酸，其中约2000万个核苷酸可能会发生改变，而不会对个人健康造成重大后果， 约20000个基因，其中近4000个与人类疾病有关。序列变化可能发生在任何核苷酸位点，包括单核苷酸变异（SNV）、小于5–10 bp（INDEL）的小插入或缺失以及结构变异。鉴于典型人类基因组中存在大量罕见的、经过预测具有破坏性效果的基因突变，将疾病的基因突变原因归结到错误的基因变异序列上的风险。因此，诊断性基因检测的一个主要困难是确定哪些基因突变是致病突变。根据《临床基因检测技术大全》，诊断性基因检测所采用的方式主包括Sanger测序、CMA和NGS方法。其中NGS测序基因检测又包括靶向基因测序基因检测包、全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）。

桑格尔测序（Sanger测序）

Sanger测序在检测致病性SNV和<5–10bp的插入或缺失方面很有效。因此，当所需要检测的肾脏疾病是单基因疾病时，这种检测方法仍然是肾脏疾病分子诊断的金标准，也是确认NGS基因检测结果的方法。桑格测序还可用于对NGS测不敏感的基因组区域，如高度重复、同源或富含鸟嘌呤胞嘧啶（GC）的区域的检测。然而，由于桑格测序仅限于<1000 bp的单个DNA片段。这种方式无法检测更大的结构变异，并且随着候选基因数量的增加，成本越来越高，时间效率也越来越低，限制了其在具有复杂基因源因的疾病的诊断性检测。
 

染色体微阵列基因检测

染色体微阵列技术（CMA）介绍

从历史上看，对基因组疾病（即由结构变异引起的遗传疾病）的检测需要用到核型分析分析技术，核型分析可以检测染色体疾病、易位和其他大型基因组失衡。然而，许多基因组疾病是由拷贝数变异（CNV）引起的，所涉及的变异大于低于1–2MB。这个变异低于核型分析所能检测的灵敏度。CMA技术可以检测小的和大的CNV基因突变。
 

临床上的CMA主要有两种形式，即阵列比较基因组杂交和单核苷酸多态性阵列。这两种技术都提供了极好的全基因组覆盖率，并在临床相关区域有丰富的探针，以实现单外显子水平的分辨率。由于这种高分辨率，CMA对智力残疾、自闭症和多发性先天性异常的诊断率比核型分析高出10倍，现在被推荐为这些疾病的一线基因检测方法。然而，与核型分析不同，CMAs无法检测平衡的染色体重排或低程度嵌合体，并且对某些区域的变化（如假基因和重复元素）的灵敏度有限。此外，CMA通常只能将CNV的边界解析为~1–2 kb，这妨碍了准确确定其大小和所影响的基因，这是诊断性CNV基因检测结果进行解释的关键标准。因此，需要根据所使用的特定CMA平台的覆盖范围和对基因组疾病的临床怀疑强度来解释研究结果。
 

染色体微阵列技术的应用

先天性肾和尿路异常（CAKUT）是小儿肾病的主要原因，可单独出现,也可以或作为多器官综合征的一部分出现。CMA已被证明是综合征性CAKUT患者的有效一线诊断工具，也可能适用于非综合征形式的患者。例如，一项对522名肾发育不良儿童的研究发现，在380名孤立性泌尿生殖系统异常患者中，有55名（14.5%）患者的CNV是在已知基因组疾病中致病性基因突变。在迄今为止发表的所有研究中，约4-10%的CAKUT患者中发现了致病性CNV，并且在肾实质缺损患者中，基因组中也肯有较多的CNV基因突变，是高达10%的患者的发病原因。这些研究在肾病儿童中发现了40多种不同的基因组疾病。常见的综合征包括17q12缺失（人类在线孟德尔遗传（OMIM）614527）、22q11.2（OMIM 188400）和16p11.2位点（OMIM 611913）的缺失。此外对419名患有全因慢性肾病（CKD）的儿童队列进行的CMA基因检测，在7.4%的患者中检测到诊断性CNVs基因突变。诊断率与已确定的发育延迟或产前检查指标一致。 重要的是，所研究的大多数患者在转到儿科肾病或泌尿科进行常规临床检查之彰并且之前没有被诊断出患有综合征形式的疾病，这突出了说明了才用常规临床诊断手段提前发现遗传性综合征的难度。 在许多情况下，对基因组疾病的诊断会对患者所罹患的疾病进行重新归类，这对后续的临床管理具有重要意义。此外，这些疾病通常具有多方面的的影响，包括代谢、骨骼和神经并发症。在没有将不同征状归结同一个基因原因的的情况下，可能会引发长戎、多种不必要的检查。或者，这种临床病征被被错误地归结于继发性肾功能不全，结果即使在经过适当的肾脏治疗后仍然无法实现缓解疾病。例如，肾病儿童出现不良神经认知结果的风险增加，但这种风险常常被认为是治疗肾病时产生的心理社会负担。然而，一项对CKD儿童的研究表明，认知能力受到损害与肾脏疾病的严重程度无关，患有基因组疾病的儿童神经认知能力较差。这些发现表明，在一些患者中，神经认知缺陷是由损害肾脏和神经精神功能的基因组疾病引起的。因此，CMA有可能解释看似不同的临床特征，确定治疗预期，并指导治疗方法。 虽然需要进一步的基因解码研究来全面确定成年肾病患者中基因组疾病的患病率和CMA基因检测的适应症，但上述儿童研究结果强烈支持其作为儿童肾病诊断评估的一线工具的实用性。
 

下一代测序Next-generation sequencing

NGS利用靶向捕获和大规模并行测序同时评估选 定的基因组区域 的基因突变，从而实现快速、经济高效的大规模基因检测分析。所选区域可以是多个感兴趣的基因 （使用靶向NGS基因检测包进行检测分析）、所有蛋白质编码区（使用WES进行检测）或者是对编码区和非编码区两者都 进行检测（使用WGS进行分析）。在当前的临床基因检测环境中，每种NGS方法都有优缺点，对最佳检测方法的选择正在迅速发展，反映在基因检测 技术的掌握能力、对成本效益的估算，并根据病 人和病人的具体情况来决定。随着测序的技术费用稳步下降，对基因检测结果进行分析解释成为决定一个检测机构能力高低的重要方面。对大量基因突变时行分析实践中的主要困难。