【佳学基因检测】不同的肺癌患者采用血液循环游离DNA检测EGFR基因突变的结果及预后

肺癌是全球致死率最高的恶性肿瘤之一，也是中国最常见的恶性肿瘤之一。每年，中国新增的肺癌病例约为60.95万，位居恶性肿瘤之首。其中，约80%的病例为非小细胞肺癌（NSCLC），且75%的患者确诊时已是晚期，无法进行手术治疗。目前，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）已成为携带EGFR基因敏感突变的NSCLC患者的一线治疗药物。通过基因检测全面了解EGFR突变对NSCLC患者治疗及预后的影响至关重要。

目前，通过活检或术后肿瘤组织进行EGFR基因检测是公认的金标准。然而，临床实践中存在诸多局限，如肿瘤组织获取困难、难以重复取材以及肿瘤异质性等问题。液体活检作为一种非侵入性或微侵入性的方法，通过检测体液中的循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环游离DNA（cfDNA）和外泌体等来获取肿瘤生物学信息。与传统组织活检相比，液体活检具有微创、可重复、患者接受度高等优点。cfDNA是指存在于患者血浆中的游离DNA片段，由正常及肿瘤细胞坏死、凋亡或主动分泌进入外周血循环，且其生物学信息与原发肿瘤高度一致。当肿瘤组织难以获取时，血浆cfDNA检测是EGFR突变分析的合适替代选择。

在对第一代EGFR-TKIs耐药的肺癌患者中，约50%会出现T790M突变。该耐药突变可能存在于原发肿瘤中，更常见于治疗后的二次活检样本。因此，在随访和监测方面，血检具有更高的可操作性。

肿瘤精准用药基因检测旨在收集肺癌患者配对的血液及肿瘤组织样本，进行EGFR基因检测分析，以探讨NSCLC患者血液循环cfDNA检测EGFR基因突变的敏感性和特异性。通过分析其临床应用及预后指导价值，为临床常规应用提供依据。

EGFR总体突变率与类型

在107例配对的血液和肿瘤组织样本中，均成功进行了EGFR基因突变分析（采用ARMS法）。统计分析显示，EGFR突变在晚期肺癌患者中显著增高，特别是在Ⅳ期患者中（血液样本67.5%，组织样本87.5%，P < 0.001，P = 0.002）。女性腺癌患者中突变率较高，但差异无统计学意义。

血浆cfDNA检测出EGFR突变60例，总体突变率为56.1%。突变类型主要包括19号外显子缺失（19 deletion, 19Del）（27例，占45%）和21号外显子突变（L858R）（22例，占36.7%）。另外11例为双重EGFR突变（compound EGFR mutations），具体包括：19Del和T790M双突变7例（11.7%），L858R和T790M双突变2例，G719X和L861Q双突变1例，以及19Del和L858R双突变1例。

配对的肿瘤组织样本中，EGFR突变检出率略高于血液样本，达到77.6%（83例）。突变类型包括19Del 44例（53.0%）、L858R 30例（36.1%），以及较少见的18号外显子（G719X）突变和20号外显子插入突变（20-INS）各1例。此外，检测到7例双重EGFR突变，包括：19Del和T790M双突变4例（4.8%），19Del和L858R双突变2例，以及G719X和S768I各1例。

血液与肿瘤组织EGFR突变结果比较

在107例配对的血液和肿瘤组织样本中，EGFR突变分析结果显示，两者完全一致的样本共73例（68.2%），其中包括49例EGFR突变型和24例野生型。检测一致的突变类型包括19Del 27例（55.1%），L858R 21例（42.9%），以及G719X L861Q双突变1例。

不一致的病例有34例（见表2），其中主要表现为假阴性，即血液样本呈野生型而组织样本为EGFR突变型（23例，占67.6%）。其余11例不一致者主要体现在EGFR突变类型差异上，尤其是血液样本中T790M突变的检出率更高（9例，占81.8%）。值得注意的是，没有出现血液样本假阳性的情况。

基于上述数据，血液cfDNA检测EGFR基因突变的敏感性为72.3%，特异性为100%。血液检测中EGFR突变型和野生型的一致率分别为81.7%和48.9%，差异具有统计学意义（P < 0.001），这提示血液检测EGFR突变阳性结果可能更可靠。19Del和L858R突变的一致率分别为61.4%和70%，两者差异无统计学意义（P > 0.05），表明血液检测这两种突变类型均较可靠。

在107例血液样本中，根据治疗状态将其分为三组。

治疗前组：共有50例患者，在这组中，血液样本中检出EGFR突变31例（62%），而配对的肿瘤组织样本中EGFR突变39例（78%）。两者EGFR突变率差异无统计学意义（P=0.081）。配对比较结果显示，完全一致的样本有37例（74%，为三组中最高），其中包括19Del突变12例，L858R突变13例，G719X L861Q双突变1例和野生型11例。检测结果不一致的样本有13例，主要为假阴性病例（9例，占69.2%）。有趣的是，有3例患者在治疗前血检中即发现含T790M双突变，而组织检测结果为阴性。

靶向治疗组：该组包含28例患者，血液样本中检出EGFR突变19例（67.9%），配对的肿瘤组织样本中检出25例（89.3%），两者差异无统计学意义（P=0.051）。与治疗前的肿瘤组织样本比较，检测结果一致的样本有16例（57.1%，为三组中最低），其中包括19Del突变样本10例，L858R突变样本3例和野生型样本3例。具体分析发现不一致的12例样本中，假阴性和检出含T790M双突变的病例各占一半。

化疗组：该组包括29例患者，血液样本中检出EGFR突变10例（34.5%，为三组中最低），而配对的肿瘤组织样本中检出EGFR突变19例（65.5%），差异有统计学意义（P=0.018）。两者检测结果一致的样本有20例（65.6%），包括19Del突变5例，L858R突变5例和野生型10例。重要的是，9例不一致的样本全部属于假阴性，提示传统化疗后血液中EGFR基因突变的检出率显著降低。

EGFR基因检测与靶向治疗预后分析

28例肺癌患者在接受靶向治疗后，通过检测血液cfDNA了解EGFR基因状态，并对其进行随访。根据血检结果，将患者分为含T790M双突变组（6例）和无T790M突变组（13例）。结果显示，含T790M双突变组患者的平均生存期为17.5个月，无T790M突变组的平均生存期为29.6个月，两者差异具有统计学意义（P < 0.05）。无T790M突变组的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）均显著长于含T790M双突变组。进一步的分层分析发现，无论性别和年龄（< 60岁或≥60岁），含T790M双突变组的预后均较差（P=0.005）。

进一步将血检结果细分为19Del突变组、L858R突变组和含T790M双突变组进行预后分析。结果显示，19Del突变组患者的平均生存期为33.2个月，L858R突变组为19个月，含T790M双突变组为17.5个月。三者在无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）方面的差异均具有统计学意义。然而，通过两两对比分析发现，19Del突变患者在靶向治疗后的PFS和OS显著长于L858R突变患者和含T790M双突变患者，而L858R突变与含T790M双突变患者的预后差异无统计学意义。

分子靶向治疗在肺癌患者中的应用及其检测方法

分子靶向治疗已成为肺癌患者常规治疗的重要部分。临床病理通常采用侵入性方法，如通过活检或手术获取的组织进行EGFR基因突变检测。虽然这些方法具有明显的优点，但其缺点也不可忽视。一方面，这些侵入性方法难以重复取材并伴有一定风险，并发症发生率可达17%。另一方面，大部分非小细胞肺癌（NSCLC）患者确诊时已是晚期，约1/3的患者无法获得适用于EGFR检测的组织样本。在这种情况下，血浆cfDNA成为肺癌患者EGFR突变检测的一种有效替代选择。近年来，这方面的研究快速发展。肺癌精准治疗基因检测通过对一组配对的血液和肿瘤组织样本进行EGFR基因检测，比较其表达差异，分析血液cfDNA能否准确检测EGFR基因突变及监测耐药基因T790M的变化，以指导患者的个体化精准治疗。

研究发现与分析

肺癌精准治疗基因检测发现，应用ARMS-PCR法检测血液cfDNA的EGFR突变总体一致率为68.2%，方法敏感性为72.3%，特异性为100%，比以往的研究[16]更佳。更有意义的是，在治疗前组中获得了血检和组织检测的最高一致率（74%），而靶向组的最低一致率为57.1%。化疗组中血液EGFR突变检出率明显低于组织（P=0.018），这与以往报道的化疗后EGFR突变率降低[17]相符。这些数据提示术后辅助治疗（包括传统化疗和靶向治疗）可能影响血浆cfDNA的构成，从而为了解残余肿瘤状态提供依据。

进一步分析血检和组织检测不一致的病例发现：①在治疗前组中，主要表现为假阴性（57.1%, 8/14），提示在无法获得原发肿瘤组织时，血检结果应谨慎解释阴性结果。②在靶向治疗组，不一致的病例中一半为假阴性，一半为含T790M双突变。生存分析发现，含T790M双突变组在无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）方面均显著差于无突变组。因此，血液cfDNA检测EGFR突变能更好地反映治疗现状并提示预后。Camidge等[18]研究发现，约一半的患者在接受连续的EGFR-TKI治疗后出现继发性T790M突变。第三代EGFR-TKI针对耐药突变T790M已进入视野，及时检测及监测用药后T790M状态成为临床关注的新热点[19, 20]。肺癌精准治疗基因检测同样提示，血液cfDNA监测T790M突变可以作为选择靶向药物的指针。③在化疗组中，不一致的病例全部表现为血检野生型而治疗前原发肿瘤组织为EGFR突变型，这提示血检在传统化疗后的随访监测中可能存在局限性。

在治疗前组中，有3例血液含T790M双突变，而配对的肿瘤组织为阴性；另有1例血检为双突变（19Del、L858R），而组织为单突变（L858R）。我们分析这种情况可能的原因包括：在组织活检取材过程中存在选择性偏差，导致局部肿瘤组织与外周血所携带的生物学信息不一致[21]；肿瘤组织的异质性也可能导致与血浆游离DNA信息差异；T790M突变的肿瘤细胞亚群可能具有更高的增殖指数，易于侵袭性生长或坏死并释放DNA入血。因此，肺癌精准治疗基因检测提示，血浆cfDNA比小体积的活检组织更能全面反映肿瘤驱动基因状态，均化组织异质性造成的检测偏差，为治疗提供更加全面的信息。

不同突变类型的预后分析

对不同突变类型的患者进行靶向治疗后的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）分析，并对年龄、性别等因素进行分层对比。结果显示，无T790M突变患者的生存期均较含T790M突变患者长（PFS及OS），且不受性别和年龄的影响。靶向治疗的不同EGFR突变类型患者中，19Del突变的预后最佳，较L858R和含T790M双突变患者的PFS和OS显著延长；而L858R突变患者较含T790M双突变患者的预后稍好，但差异无统计学意义。与肺癌精准治疗基因检测一致，有文献[22-25]报道19Del突变患者的靶向治疗生存期较L858R突变患者更长。

结论

综上所述，应用ARMS法检测血浆cfDNA的EGFR基因突变是一种特异性高、敏感性好的检测方法，适用于晚期治疗前肺癌患者的靶向检测，是无法获得组织样本时的合适替代方法。其优势在于能够全面反映肿瘤EGFR基因状态，减少组织异质性造成的检测偏差。同时，该方法适用于应用靶向治疗后：①监测T790M耐药突变状态，实时反映治疗效果，指导用药；②具有预后价值。然而，其局限性在于：①需谨慎解释阴性结果；②传统化疗后可能出现假阴性。全面了解这一检测方法的优缺点，有助于临床选择开展相应工作及正确解读结果。