【佳学基因检测】循环肿瘤DNA为什么可以用来做靶向药物基因检测？

循环肿瘤DNA是一种微创基因检测技术

循环肿瘤DNA检测可以反映肿瘤DNA的稳定性

在1948年，人们在人类血浆中发现了一种无分数的DNA片段，称为cfDNA。ctDNA是与肿瘤发展相关的一种cfDNA。然而，ctDNA的来源并未明确指出，通过一系列的来源比较结果，主要推测ctDNA主要来源于肿瘤细胞的程序性凋亡或坏死。这个概念一直深入研究者的心中，但是通过基因解码发现，癌症患者的血液样本中的循环外泌体也含有与ctDNA相同的突变位点，如KRAS基因的G12A。而且，循环外泌体中的基因突变比例高于血液中的ctDNA，这表明含有多种组分的循环外泌体可能是ctDNA的另一个来源，拓宽了ctDNA的来源，并为精确的ctDNA分析提供了新的思路。更深入地了解ctDNA的来源，可以进一步澄清各种类型癌症在特定基因水平上的变化，这有利于后续的靶向药物研究和治疗。ctDNA揭示了肿瘤相关的基因水平的DNA变化，包括基因突变、DNA甲基化、MSI、基因重排和杂合性丧失。微卫星不稳定性是指肿瘤中的一个微卫星位点与正常组织相比，由于重复单位的插入或删除，产生了新的微卫星等位基因的现象。MSI的发生是由于肿瘤组织中的DNA错配修复功能缺陷，而且与DNA错配修复缺陷的MSI是一个重要的临床肿瘤标记。肿瘤稳定性基因解码基因检测首次在前列腺癌患者的cfDNA和ctDNA中检测到MSI，结果与转移病人组织全外显子测序的结果一致。此外，在给予了抗CTLA-4抑制剂nivolumab和美国食品药品监督管理局批准的一线药物pembrolizumab治疗的三名Mismatch repair deficiency/high MSI metastatic colorectal cancer患者中，观察到ctDNA水平急剧下降，这表明MSI在ctDNA中仍然是一个临床生物标志物。此外，肿瘤基因检测的人工智能分析人员开发了一个基于cfDNA测序数据的MSI生物信息学工具，其灵敏度为100%，检测限值为0.05%的ctDNA含量。

循环肿瘤DNA基因检测是否可以发现杂全性缺失

杂合性丧失意味着，在同源染色体上特定位点的一对等位基因中，一侧有有害突变，而另一侧正常，导致半纯合子或纯合子基因位点。杂合性丧失是NF1基因突变的主要形式。之前的一项研究显示，14例侵袭性小叶或导管乳腺癌患者中有11例出现NF1基因的杂合性丧失，这种变异与内分泌治疗抵抗和RAS/RAF激酶的激活相关，表明患者在用适当的激酶抑制剂治疗后，预后会更好。基因重排是一种常见的基因水平变化形式，是DNA双链断裂后的基因内或基因间重排的修复结果，包括基因融合。在来源于转移性结直肠癌患者的血液和尿液的ctDNA的二代测序光谱中，发现了CAD-ALK基因融合。CAD基因的外显子35和ALK基因的外显子20的联合重排，以及CAD-ALK基因融合的动态变化，与患者的临床进展一致。

循环肿瘤DNA与基因突变检测

基因突变被认为是基因结构中碱基配对组成或排列顺序的改变，包括点突变、移码突变、缺失突变和插入突变。DNA甲基化是一种表观遗传修饰，由DNA甲基转移酶（DNMT）催化。S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，甲基被选择性地加到胞嘧啶的两个CG核苷酸的DNA上。主要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC），这在基因5′-CG-3′序列中很常见。DNA甲基化可能导致基因组相应区域的染色质结构发生变化，导致DNA失去核糖酶或限制性内切酶的切割位点和DNA酶的敏感位点。这导致形成的染色质高度螺旋并凝聚成团，失去其转录活性。

来源于肿瘤细胞的ctDNA，含有肿瘤特异性的基因突变位点和甲基化位点，如非小细胞肺癌（NSCLC）中的EGFR基因，乳腺癌中的BRCA1/2突变和甲基化，结直肠癌中的KRAS基因突变，以及甲状腺癌中的BRAF基因突变。此外，在ctDNA检测过程中，可以通过测序结果或相应的感测信号，包括电流变化、光学变化和吸收度，来识别和确定突变或甲基化。基因突变和DNA甲基化是肿瘤基因检测中的两个方面。

佳学基因肿瘤基因检测如何获取循环肿瘤DNA

ctDNA提取

ctDNA检测的过程包括ctDNA的提取，相关库的建立，分析，以及数据的整合和对比。在此过程中，ctDNA的提取是第一步，也是改善结果的决定因素。首先，ctDNA的来源是一个关键因素，它有多种可能，如血液，尿液，粪便，唾液，腹水，脑脊液，和胸腔积液。其次，针对不同来源选择提取ctDNA的方法也是至关重要的。提取阶段主要分为两个步骤：样本处理和ctDNA的提取。

3血液

在几乎所有的实体瘤中，血液是提取ctDNA的最常见来源，如食管癌，非小细胞肺癌，结直肠癌，肝细胞癌，以及早期乳腺癌。首先，从被检查的对象中抽取血液，并收集在EDTA血液收集管中，如果样本将在2小时内处理，或者在防腐管中，如果样本将在抽血后的46-72小时内处理。有趣的是，不同来源的ctDNA的检测效率是不同的，如血浆，血清，和外周血。血浆的检测效率被发现比其他来源更好，其检测特异性和灵敏度分别为0.96和0.78。此外，收集效率受管子选择的影响，适当的管子可以扩大临床上的血液收集范围。例如，EDTA，CellSave管，和Streck BCT在血样采集后6小时内具有相似的保存血液的能力，而CellSave管和Streck BCT可以在48小时内稳定野生型DNA和ctDNA。然后，将样品在1600× g的离心力下离心10分钟，收集上清液，并在16,000× g的离心力下离心10分钟。其次，使用提取试剂盒准确地获得ctDNA，目前有许多商业上可用的ctDNA提取试剂盒用于临床基因检测和科学研究，如QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (Qiagen, Hilden, Germany)，QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (Qiagen, Hilden, Germany)，MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)，QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany)，以及EliteHealth cfDNA提取Kit (EliteHealth, Pembroke Pines, FL, USA)。几种提取试剂盒在表1中列出。

ctDNA来源   选择性试剂盒

血液               QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit

MagMAX™   Cell-Free DNA Isolation Kit

DSP               Circulating DNA Kit

QIAamp         Circulating Nucleic Acid Kit

EliteHealth     cfDNA提取Kit

尿液 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit

脑脊液 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit

QIAsymphony    DSP Virus/Pathogen Midi Kit

QIAsymphony    DSP Circulating DNA Kit

粪便                   Fast DNA Stool Mini Kit

腹水                   QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit

胸腔积液           QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit

尿液

尿液是比血液更方便的ctDNA来源，特别是对于肾癌，结直肠癌，膀胱癌，和尿路上皮癌，因为样本的收集不会对患者造成不适。尿液分为尿液上清液(USN)和尿液细胞沉淀(UCP)进行ctDNA的收集。通常，从患者体内收集30-50毫升的尿液在50毫升的Falcon试管中，然后在收集后的一个小时内向Falcon试管中添加0.5 M的EDTA。在EDTA溶解后，将样品在2400× g的离心力下离心10分钟。然后，使用独立的冻存管存放上清液，存储在-80 °C的条件下。如果想获得UCP收集，以上的1毫升上清液添加到含有UCP的原始Falcon试管中，然后在轻轻搅拌后将悬浮物转移到2毫升的无菌微离心管中。沉淀物通过在13,300转每分钟的离心速度下存放在-80 °C的条件下。此外，QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany)也可以用于从尿液中提取ctDNA。

脑脊液

中枢神经系统(CNS)疾病占据了大部分影响患者生活质量的疾病。血液来源的ctDNA逐渐成为癌症的新型生物标志物，但脑瘤患者的脑脊液中ctDNA的浓度高于血浆。总的来说，脑脊液与CNS肿瘤的来源更为密切相关[52,53]。脑脊液样本通常从患者的腰椎穿刺中获得，离心后，可以使用QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (Qiagen, Hilden, Germany)，QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (Qiagen, Hilden, Germany)，以及QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany)进行ctDNA的提取。

粪便，腹水，和胸腔积液

粪便，腹水，和胸腔积液是提取ctDNA的补充来源。通过相对离心，使用Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)  和 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany)  收集上清液。所有选择性的ctDNA提取试剂盒都在表1中显示。