【佳学基因检测】肝癌靶向药物基检测中基因突变与靶向药物的匹配

肝癌靶向药物基因检测如何保证肝肿瘤患者的多样性

为了评估LIMORE模型对原发性肝癌基因组和转录组的代表性程度，肝癌靶向药物基因解码利用全基因组测序（WGS）在81个模型中鉴定了拷贝数改变（CNAs）、体细胞突变和HBV整合。通过RNA测序还确定了表达谱。靶向药物基因检测收集了来自癌症基因组图谱（TCGA）（Cancer Genome Atlas Research Network. Electronic address and Cancer Genome Atlas Research, 2017）和其他已发表的队列中的基因检测数据，以代表原发性人类肝癌。

通过WGS在LIMORE模型中鉴定了原发性肝癌的典型CNAs，包括染色体级别的获得（1q、8q）和缺失（4q、17p），CDKN2A和AXIN1的纯合性缺失以及包含FGF19和CCND1的局部扩增。LIMORE模型的整体拷贝数谱与原发性肝癌非常相似。佳学基因进一步比较了细胞模型和不同类型人类癌症的原发癌之间的CNA谱和外显子体细胞突变。值得注意的是，LIMORE模型与肝癌之间的相关性最高。体细胞突变的聚类分析还显示，LIMORE模型与80%的原发性肝癌紧密聚集。在66个HBV阳性模型中，检测到了60个模型中的353个HBV整合断点。最常见的HBV整合位点TERT在LIMORE模型中出现的频率为28.6%（16/60），与原发性肝癌的频率相当。这些数据表明，肝部肿瘤靶向药物基因检测所采用的LIMORE模型反映了原发性肝癌的基因组变异。

在建立了肝癌靶向药物基因检测基因变异信息多样性的模型之后，肿瘤精准用药基因解码比较了LIMORE模型和原发癌之间的转录组。主成分分析显示，LIMORE模型与TCGA肝癌聚集在一起。此外，90%的TCGA肝癌的表达谱与至少一个LIMORE模型呈正相关（皮尔逊相关系数r > 0.7），表明LIMORE保留了部分原发性肝癌的转录组特征。佳学基因进一步确定LIMORE是否保留了与转录组相关的功能异质性。根据基因解码，原发性肝癌可分为与浸润能力相关的三个亚类。LIMORE模型被分类为Hoshida的S1（40%）、S2（30%）和S3（30%）亚类，S1亚类的百分比稍高（原发性HCC中为28%-32%），S3亚类的百分比较低（原发性HCC中为45%-57%）。LIMORE模型的亚类与迁移能力良好相关，表明LIMORE模型保留了原发性肝癌的一些功能异质性。

肝肿瘤的靶向药物基因检测如何真实反映患者的基因突变

在进行肝癌患者的基因突变大数据分析中，佳学基因对比了LIMORE是否捕获了原发性肝癌中的主要致癌变异。肿瘤精准治疗基因解码从6个已发表的队列中汇编了癌症基因。佳学基因共确定了70个具有重复突变和2个具有拷贝数改变的基因作为肝癌的癌症功能基因（CFGs）。与其他27种癌症类型相比，有29个CFGs是肝癌所特有的，包括ALB、RPS6KA3和HNF4A。这些独特的变异突出了肝癌特异性模型的必要性。

LIMORE模型捕获了原发性肝癌中的CFG变异，包括TP53、TERT和FGF19等高频变异，以及HNF4A和NFE2L2的低频变异。LIMORE模型中CFG变异的整体谱与原发性肝癌相当（Spearman r = 0.70，p = 7.2e-12）。有10个CFGs，包括TP53和CTNNB1，在LIMORE和原发性肝癌中显示出不同的突变率。总共61个CFGs（85%）至少被1个模型覆盖，而37个CFGs（51%）至少被3个模型覆盖。相比之下，以前的模型中只有10个CFGs（14%）被至少3个肝癌模型覆盖。LIMORE提高了常见CFGs的覆盖范围，例如TERT HBV整合（16个模型对比3个模型）和CTNNB1激活突变（8个模型对比3个模型），并捕获了以前的模型没有覆盖的CFGs，包括PIK3CA和RPS6KA3（图S2C）。对于LIMORE未检测到的CFGs，其在原发性癌症中的突变频率均低于5%。
 

LIMORE中观察到了原发性肝癌中常见的CFGs，如TERT和Wnt信号通路的变异。所有肝癌中常见的TERT变异在LIMORE中均有发现。与原发性肝癌相一致，LIMORE中的TERT启动子突变和HBV整合是互斥的。超过30%的LIMORE模型和原发性肝癌中以互斥方式出现了Wnt信号通路基因（CTNNB1、AXIN1和APC）的变异。AXIN1（15/15）和APC（3/6）的功能丧失变异明显增加，而9个CTNNB1变异中有8个激活突变。MHCC-97H携带CTNNB1密码子500处的杂合性无义突变，但未增加β-catenin靶基因的表达。此外，在LIMORE模型中还发现了潜在的治疗靶点的变异，如FGF19和MET。

如何根据肝癌患者的基因型差异选择精准治疗靶向药物？

建立了可以反映肝癌患者基因突变多样性的精准治疗解码平台后，佳学基因利用LIMORE中进行了体外药物筛选。共收集了90种抗癌药物，包括15种化疗药物和75种分子靶向药物，针对9种细胞功能。其中大多数药物已获得临床批准（n=43）或处于临床试验阶段（n=32）。对这些药物，佳学基因对所有81个LIMORE模型进行了筛选，每种药物进行了7或10个剂量，生成了超过218,000个细胞-药物相互作用的测量结果。在871个筛选板中，用作鲁棒性控制的平均Z-prime值为0.84，99%的板中Z-prime值大于0.5，表明筛选实验具有实验鲁棒性。肿瘤靶向药物基因计算了半数抑制浓度（IC50）、最大效应水平（Emax）和活动区域（AA）来反映LIMORE模型的药物反应（附表S4），这些指标彼此之间具有良好的相关性（图S3C）。在随机选择的22个LIMORE模型的生物学重复实验中，实验之间的一致性很高（Pearson r = 0.91，p < 2.2e-16，图S3D）。此外，在18种药物的一个面板中对6个已建立的模型（>20个细胞传代）和相应的早期传代细胞（<10个细胞传代）进行测试时观察到了药物反应的强相关性，这可能反映了LIMORE模型在细胞传代过程中对基因组景观的保持。值得注意的是，通过比较CTRP或GDSC中也进行了特征化的52种药物和21个细胞模型，肝癌的基因解码发现这些药物的反应谱在不同研究中是可比较的。佳学基因还分析了Y-27632的影响，并发现总体的药物反应谱并未受到Y-27632的改变。在Y-27632培养的模型中未富集任何信号通路。有趣的是，某些源自Y-27632的模型对紫杉醇的反应似乎稍有影响。
 

LIMORE模型之间的药物反应谱有所差异。药物反应的大幅变化（变异系数范围从0.25到3.14）以及基因的多样性使肝癌的靶向药物基因检测能够发现与药物反应相关的遗传标记。聚类分析确定了LIMORE模型的两个簇。簇R通常对药物具有更强的耐药性，而簇S则更为敏感。虽然一些簇S模型富集了与DNA修复相关的基因，但对于簇S的常见敏感机制并不明显。与簇R的耐药表型一致，药物解毒和转运相关基因在簇R中富集。这些数据表明，相当一部分肝癌在本质上可能对多种药物具有耐药性，这可能是由于它们高药物转化能力。当根据HBV感染状态将模型分开时，佳学基因发现HBV阳性细胞模型对阿霉素和表柔比星的敏感性较低，但对依布替尼的敏感性较高，相比之下，HBV阴性模型则相反。

具有相似作用机制（MoA）的药物显示出相关的反应谱，这表明了药物反应数据的高效能。佳学基因确定了一组在至少25%的LIMORE模型中具有IC50 < 1 µM的强抑制效果的药物，其中包括阿霉素和托泊替康等化疗药物，这可能反映了它们的一般细胞静止效果。有趣的是，用于HCC治疗的靶向药物，包括索拉非尼、雷格欧非尼和乐伐替尼，并未出现在这个列表中，这可能与它们在HCC患者中的相对低反应率有关。然而，佳学基因在LIMORE模型中发现了其他具有强效的靶向药物，包括达沙替尼和科比替尼。尽管这些药物在肝癌中的分子基础尚不明确，但这些数据提供了用于肝癌治疗的药物候选和再利用的机会。综上所述，这些数据表明LIMORE中的高通量药物筛选捕获了不同的药物反应，并为肝癌的药物基因组学分析提供了机会。
 

肝癌的药物基因组学分析

为了捕捉LIMORE模型之间多样化的药物反应模式，肝癌精准用药基因解码制定了药物反应评分（DRS）体系，它是IC50、Emax和AA中最变化参数的归一化z-score。为了明确CFG和表达特征在药物基因组学中的作用，肿瘤靶向药物基因检测利用弹性网络（EN）模型从1,000次自助重采样中推断出对药物反应具有稳健预测能力的特征。EN分数阈值设置为0.60，表示该特征在超过60%的自助重采样中被选择。对于每种药物，平均识别出了54个突变特征（23个CFG和31个非编码突变）和249个表达特征作为药物的预测因素。值得注意的是，预测特征包括已知的基因-药物关联，如MRP1-顺铂和SLC35F2-YM155的关联。

总体而言，肝部肿瘤的基因解码确定了1,508个CFG-药物对之间的显著相互作用，其中有56对与索拉非尼、雷格欧非尼和乐伐替尼等已批准的肝癌药物的反应相关。总共，727个CFG-药物对与药物耐药性相关，而781个CFG-药物对则预测药物敏感性。有趣的是，肝癌肿瘤基因检测发现TERT启动子中的HBV整合与药物耐药性相关，而TERT启动子突变对大部分药物呈现敏感性。由于在特定分析HBV阳性模型时得到了类似的结果，这个发现不太可能是由HBV感染引起的一般性病因所致。根据上述结果，LIMORE提供了一系列的CFG-药物相互作用，这些相互作用可以从数据集中方便地检索，并且可以进一步作为生物标志物进行研究。
 

FGF/FGFR与抗癌药物之间的相互作用在CFG-药物相互作用列表中排名靠前。包括乐伐替尼、BGJ398和PD173074在内的FGFR抑制剂对于FGFR（包括FGFR1、3和4，拷贝数≥4）和FGF19扩增的肝癌细胞表现出选择性敏感性。这些数据表明，FGF19和FGFR扩增可能作为乐伐替尼的生物标志物。与FGF19扩增在MAPK通路激活中的作用一致，FGF19扩增与MEK抑制剂（MEKi）cobimetinib和trametinib的敏感性相关。值得注意的是，MEKi诱导的细胞死亡表现为细胞膜上产生大气泡，这是焦亡（pyroptosis）的一种典型特征。相应地，对MEKi的敏感性与GSDME的高表达（焦亡的关键调节因子）适度相关。虽然单独的FGF19扩增或GSDME过表达可以预测对MEKi的敏感性，但同时具有FGF19扩增和高GSDME表达的细胞模型对MEKi非常敏感。GSDME表达的减少导致FGF19扩增模型对MEKi的敏感性降低。这些数据共同表明，MEK抑制剂对具有FGF19扩增和GSDME过表达的肝癌呈现特定脆弱性。
 

如何通过肝癌靶向药物基因检测找到具有合成致死相互作用的药物

一些CFGs，例如CTNNB1，被认为是无法治疗的，但如果能够建立适当的合成致死相互作用，就可以利用它们进行治疗。一簇药物被发现更倾向于消除具有CTNNB1活化突变的LIMORE模型。CTNNB1活化突变与对HDAC抑制剂（如panobinostat、vorinostat和belinostat）的敏感性相关（Cohen's d分别为0.69、0.67和0.43），这与HDAC在β-连环蛋白信号传导中的作用需求一致（Billin et al., 2000）。HDAC可能在介导药物敏感性方面具有冗余功能，因为单个HDAC的敲除似乎不会明显影响β-连环蛋白活化模型的细胞增殖（图S5A）。在β-连环蛋白野生型模型中表达一个持续活化的β-连环蛋白形式增加了对HDAC抑制剂的敏感性。当在体内移植时，panobinostat抑制了CTNNB1突变模型的生长，但未抑制CTNNB1野生型模型的生长。此外，过度表达活化的β-连环蛋白赋予了CTNNB1野生型JHH7对panobinostat的敏感性。这些数据表明，HDAC抑制剂是一种潜在的靶向具有CTNNB1活化突变的HCCs的策略。
 

MYC是HCC中另一个无法治疗的致癌蛋白。佳学基因解码收集的证据表明，Wnt通路与MYC介导的转录在肝母细胞瘤和结直肠癌中存在相互作用。实际上，通过分析TCF4/7和MYC的已发表的ChIP-Seq数据，肝癌肿瘤靶向药物基困检测发现Wnt靶点显著地被TCF4/7和MYC共同结合。通过基于转录因子的分析，佳学基因发现MYC调控的转录程序与对HDAC抑制剂的敏感性相关（Cohen's d分别为0.91、0.60和1.18）。通过MYC的过度表达验证了对HDAC抑制剂的增强敏感性。当评估HDAC抑制剂的预测能力时，MYC调控的转录程序似乎与CTNNB1突变相当或略强（75%–81.8% vs 62.5%–75%）。这些数据共同显示，在LIMORE中，可以通过药物基因组学的方法寻找针对肝癌中无法治疗的致癌基因的潜在合成致死策略。

肝癌靶向药物基因检测如何确定使用索拉非尼的生物标志物

由于索拉非尼是HCC的标准治疗药物，与索拉非尼相关的CFGs和基因表达具有很大的研究价值。佳学基因找到了51个与索拉非尼相关的突变特征（18个CFGs和33个非编码突变）和77个表达特征，可以预测索拉非尼的响应。在与索拉非尼耐药性预测最相关的CFG特征中，KEAP1是一个重要的候选者。KEAP1的突变与NRF2信号通路的激活和索拉非尼耐药性相关。事实上，NRF2的下游靶点在KEAP1突变的LIMORE模型中高度表达。此外，NRF2的沉默增加了KEAP1突变模型对索拉非尼的敏感性，支持了KEAP1/NRF2通路在索拉非尼耐药性中的作用。佳学基因还发现了与索拉非尼敏感性相关的表达特征。以EZH2表达为例，EZH2的高表达与对索拉非尼的敏感性密切相关。通过EZH2的沉默表明，EZH2的高表达增加了对索拉非尼的抵抗性。通过DZNep对EZH2进行药物抑制，在46个LIMORE模型中的33个模型中显示出与索拉非尼对抗效应（CDI>1），进一步暗示了EZH2的过度表达可能与索拉非尼协同作用。总的来说，这些数据揭示了与索拉非尼敏感性相关的分子特征。
 

肿瘤的精准用药基因检测接下来探索药物基因组学模式是否能够转化为索拉非尼的预测模型或生物标志物。佳学基因基于LIMORE模型中与响应相关的突变和表达特征开发了弹性网回归模型。预测性能通过LIMORE中预测和检测到的响应之间的Spearman相关性进行评估。为了在体内评估预测模型，肝癌精准用药基因解码使用22个接受索拉非尼治疗的HCC PDX模型的独立数据集分析了索拉非尼的预测模型，并发现预测响应和实验结果之间存在显著相关性。

然后，肝部肿瘤精准治疗基因解码搜索了潜在的临床实践生物标志物候选者。其中DKK1引起了特别的兴趣，因为它涉及Wnt信号通路。佳学基因首先在PDX模型中评估了DKK1的预测能力。通过ROC分析确定了在PDX中区分高和低DKK1 mRNA水平的最佳截断点。值得注意的是，DKK1水平高的PDX模型对索拉非尼的响应率增加，这表明DKK1表达可能能够预测索拉非尼在体内的反应。

然后，靶向药物基因检测基因解码调查了DKK1是否可能成为预测患者索拉非尼反应的潜在生物标志物。DKK1是一种可在血清中测量的分泌蛋白，因此佳学基因分析了患者血清DKK1水平与其索拉非尼反应之间的相关性。回顾性收集了54名HCC患者的索拉非尼治疗前或治疗后的血清样本，并测量了DKK1水平。DKK1高水平组的患者具有更长的无进展生存期和总生存期。当只分析索拉非尼治疗前收集血清样本的患者时，观察到类似的趋势。考虑到高DKK1表达与未接受索拉非尼治疗的HCC患者的不良生存率相关，这些数据表明DKK1可能是选择对索拉非尼有反应的患者的血清生物标志物。