【佳学基因检测】恩诺单抗（Enfortumab Vedotine）基因检测靶向治疗膀胱癌

靶向药物基因检测导读：

恩诺单抗(enfortumab vedotin-ejfv)是针对肿瘤物靶点Nectin-4的一种属于免疫单抗药物的肿瘤靶向治疗工具。该药物的中名称还包括：恩福妥单抗维多汀。基因解码表明Nectin-4是一种位于细胞表面的粘附蛋白。Nectin 细胞粘附蛋白 4 (Nectin-4) 在多种人类恶性肿瘤中过度表达。 这种异常表达与癌症进展和不良预后相关。 Nectin-4 已成为一种潜在的生物标志物和有前途的靶向治疗。 临床前模型一致证明 Nectin-4 位于细胞膜和细胞质中。 此外，无论实体瘤的位置如何，Nectin-4 都会过表达。 有趣的是，在膀胱尿路上皮癌中突出了 Nectin-4 表达的异质性。 高血清 Nectin-4 水平与治疗效率和疾病进展相关。 最后，生成的抗药物缀合靶向 Nectin-4 在多种肿瘤细胞系中诱导细胞死亡。 Nectin-4 因其在肿瘤发生和淋巴管生成中的核心作用而成为抗癌药物开发的有希望的靶标。 以 Nectin-4 为靶点的 Enfortumab vedotin 显示出令人鼓舞的结果，应该扩展到其他类型的实体瘤。

恩诺单抗靶基因在膀胱癌的表达研究：基因检测的科学依据

由NECTIN4基因（以前称为PVRL4）编码的表面蛋白 NECTIN4 是一种免疫球蛋白样跨膜蛋白，在尿路上皮癌中高度表达，最近已成为新的药物靶点。Enfortumab vedotin（EV；以前称为 ASG-22CE）是一种抗体-药物偶联物 (ADC)，可将单甲基 auristatin E (MMAE)（一种微管去稳定剂）递送至表达 NECTIN4 的肿瘤细胞。最近一项恩诺单抗的 II 期临床试验单药疗法 (EV-201) 在经过大量预处理的转移性或局部晚期尿路上皮癌患者中表现出 44% 的总体反应率，这导致 FDA 加快批准。 正在进行多项附加试验，以评估局部晚期和转移性尿路上皮癌使用或不使用免疫检查点抑制剂和/或铂类化疗的 EV。 随着恩诺单抗进入早期疾病状态并纳入一线环境，了解分子预测对恩诺单抗的反应和描述耐药机制的特征对于最大化临床疗效至关重要。

NECTIN4 在膀胱癌中的表达尚未明确，迄今为止有限的研究显示出相互矛盾的结果。虽然几乎所有参加 EV-201 的患者 (97%) 都有可检测到的 NECTIN4 H 分数（中位数 290；范围 14-300）， 似乎存在表达差异。在一项针对 524 例原发性膀胱肿瘤的研究中，仅 63% 的样本具有中度至强 H 评分 (H≥100)。此外，最近的病例系列发现 NECTIN4 染色高度可变——仅 24%纯尿路上皮癌具有中等至强的 H 评分 (H≥100)，而具有混合组织学的肿瘤的尿路上皮成分具有弱和异质染色。 

尿路上皮癌的分子亚型突出了致癌机制、免疫浸润和临床病理学特征的根本差异。最近，描述了六种关键的共识亚型：管腔乳头状 (LumP)、管腔非特异性 (LumNS)、管腔非特异性不稳定 (LumU)、基底/鳞状 (Bas/Sq)、富含基质和神经内分泌样（NE 样）。NECTIN4 是否在尿路上皮癌的六种分子亚型中普遍且一致地表达仍然未知。佳学基因解码基因检测分析了七个临床数据集中的NECTIN4基因表达，包括顺铂后新辅助化疗队列。 基因解码的目标是检查不同膀胱癌亚型的表达差异，并确定单独调节NECTIN4表达水平是否会改变对恩诺单抗的敏感性和耐药性。
 

NECTIN4 富含肌肉浸润性膀胱癌的管腔亚型

为了评估跨分子亚型的NECTIN4 mRNA 表达，泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略分析了七组局限性膀胱肿瘤患者的NECTIN4 mRNA 表达。使用共识分类器亚型，泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略发现管腔肿瘤（LumP、LumNS、LumU）与基础、NE 样或富含基质的亚型相比具有更高的NECTIN4 mRNA 基因表达。使用 TCGA、Lund 和 Decipher 分类器进行的分子分型也表明NECTIN4 mRNA 在管腔亚型中的高表达。在先前接受过基于顺铂的新辅助化疗（NAC 后）的患者中，NECTIN4 mRNA 表达在根治性膀胱切除术标本的管腔样簇 (CC2) 中也最高。有趣的是，驱动膀胱癌管腔细胞命运的转录因子（ GATA3、PPARG、FOXA1）的表达水平与多个队列中的NECTIN4表达呈正相关。在可获得回顾性临床数据的队列中，未发现NECTIN4表达的四分位数与总生存期之间存在显着关联。膀胱癌组织微阵列 (TMA) 中 NECTIN4 蛋白的免疫组织化学染色也显示出显着的表达异质性。NECTIN4 蛋白主要定位于阳性肿瘤的细胞表面，H 评分与分子亚型相关，在管腔亚型中发现 NECTIN4 蛋白表达最高。

泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略还发现，与 Seiler 队列中的女性相比，男性患者的NECTIN4 mRNA 表达更高，并且与 MOL 队列中的 pT2 肿瘤相比，患有病理性 T1 期肿瘤的患者更高。NECTIN4 mRNA 表达在其他临床变量（包括年龄和临床分期）中的差异在这些队列中并不显着。

NECTIN4 表达在人管腔膀胱癌细胞中富集

人膀​​胱癌细胞系已分为管腔型和基底亚型。泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略发现NECTIN4 mRNA 表达在管腔型膀胱癌细胞系中也有所增加（p<0.0001）, 与管腔转录因子GATA3的表达密切相关（n=36 尿路上皮癌细胞系，p=0.00007）并且对细胞存活不是必需的（基于数百个细胞系的 RNAi 敲低和 CRISPR 敲除）。与基底细胞系（253JBV、UMUC-3 和 TCCSUP）相比，管腔细胞系（UMUC-9、HT-1197 和 HT-1376）的细胞表面内源性 NECTIN4 蛋白水平也显着更高，这与总蛋白表达相关水平。

Luminal 细胞以具有更多上皮形态的粘聚簇生长，而基底细胞具有纺锤形、间充质形态。有趣的是，根据 mRNA 表达，一些归类为基础的膀胱癌细胞系（即 UMUC-14、VMCUB1 和 647V）也表达NECTIN4 。泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略验证了其中两个细胞系（UMUC-14 和 647V）中 NECTIN4 的细胞表面和总蛋白表达，与 HT-1376 细胞相比，它们在细胞表面表达可检测但较低的 NECTIN4 蛋白。647V 细胞看起来更像管腔，而 UMUC-14 细胞与 UMUC-3 和 TCCSUP 细胞相比表现出中间形态，这与 NECTIN4 在细胞粘附中发挥作用一致。

NECTIN4 表达对于恩诺单抗诱导的细胞死亡是必要且充分的

然后泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略研究了管腔细胞和基底细胞是否对恩诺单抗具有不同的基线敏感性，发现 HT-1376 和 HT-1197 管腔细胞（高内源性 NECTIN4）对恩诺单抗比 UMUC-3 和 TCCSUP 基底细胞（几乎没有内源性 NECTIN4）更敏感), 具有很强的抗性。此外，尽管可检测到 NECTIN4 表达水平，但基础 UMUC-14 细胞对恩诺单抗诱导的细胞死亡具有抗性，而与 HT-1376 细胞相比，647V 细胞具有中等敏感性（IC 50 ~3 μg/mL）。综上所述，这些结果表明NECTIN4 mRNA 和蛋白表达在管腔膀胱癌细胞系中更高，因此，它们对恩诺单抗诱导的细胞死亡也更敏感。

接下来，泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略询问luminal HT-1376 细胞中NECTIN4的敲低是否可以消除对恩诺单抗的敏感性。为此，泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略生成了表达催化失活 dCas9（称为 CRISPR 干扰或 CRISPRi）的 HT-1376 细胞，并使用 5 种独特的 sgRNA 来沉默NECTIN4。泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略发现所有 5 种 sgRNA 都有效地沉默了NECTIN4 mRNA 和 NECTIN4 细胞表面蛋白表达 > 90%，如通过定量聚合酶链反应 (qPCR) 和表面蛋白染色检测到的。NECTIN4敲低细胞保留了大致相似的管腔形态，具有一些纺锤形特征。

重要的是， NECTIN4的缺失导致了恩诺单抗耐药性。具有强大NECTIN4表达的 HT-1376 对照细胞在 0.02 μg/ml 的恩诺单抗下被完全抑制，而 HT-1376 NECTIN4敲低细胞需要 1 μg/ml 的恩诺单抗才能被抑制，这代表了 25 倍的灵敏度差异。克隆形成试验证实了NECTIN4的缺失赋予对恩诺单抗的抗性的观察结果。NECTIN4的缺失还导致第二种管腔膀胱癌细胞系 HT-1197 出现恩诺单抗耐药性。

为了研究NECTIN4表达是否单独介导恩诺单抗诱导的细胞死亡，泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略在基础 UMUC-3 细胞系中组成型表达NECTIN4 。表面蛋白染色和 qPCR 表明 NECTIN4 被强烈表达。

此外，通过免疫组化证实NECTIN4蛋白主要定位于UMUC3-NECTIN4过表达（OE）肿瘤异种移植物的细胞表面；在基底 UMUC3 对照肿瘤异种移植物中未发现可检测的内源性 NECTIN4 蛋白。重要的是，上调UMUC-3 细胞中的NECTIN4表达导致对恩诺单抗的敏感性显着增加，如增殖所证明的那样和克隆形成试验。

泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略在第二个基底膀胱癌系 TCCSUP 中发现了类似的结果。总之，泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略的结果表明NECTIN4表达是恩诺单抗诱导的细胞死亡所必需的，并强调了以下发现：i) NECTIN4的下调或缺失可能是一种重要的耐药机制，并且 ii) 诱导NECTIN4表达会增加恩诺单抗敏感性。

关于恩诺单抗靶向药物基因检测对尿路上皮癌治疗的影响

扩大晚期尿路上皮癌的治疗选择仍然是一个关键的未满足需求，正如恩诺单抗迅速纳入三线转移环境所表明的那样。新辅助空间也为其他治疗做好了准备——60% 接受现有基于顺铂的方案治疗的患者在根治性膀胱切除术中被发现有残留的浸润性疾病，在管腔型肿瘤中获益不明显。在这项研究中，泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略发现跨分子亚型的NECTIN4表达存在显着异质性，在管腔癌中表达最高。NECTIN4还与GATA3、FOXA1和PPARG密切相关，这是已知决定管腔细胞命运的转录因子。值得注意的是，NECTIN4在 NE 样亚型中最低。泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略还发现NECTIN4表达在后 NAC CC2 管腔分子亚型中仍然最高。总而言之，这种变异性可能反映了潜在肿瘤生物学的差异，并且对管腔肿瘤对基于恩诺单抗的新辅助或辅助治疗方案的敏感性具有重要意义。有趣的是，>90% 的上尿路尿路上皮肿瘤也是管腔型的，可能表达更高水平的NECTIN4。

在这里，泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略发现NECTIN4表达对于恩诺单抗诱导的细胞死亡至关重要。使用代表性的管腔（HT-1376、HT-1197）和基底（UMUC-3、TCCSUP）细胞系，泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略证明管腔细胞中NECTIN4的敲低导致恩诺单抗抗性，而 NECTIN4 在基底细胞中的表达导致恩诺单抗敏感性。据泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略所知，这些数据首次正式证明NECTIN4的表达是尿路上皮癌临床前细胞系模型中恩诺单抗治疗效果的关键决定因素。泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略的数据证实并建立在现有的临床前体外和体内数据。有趣的是，泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略发现一些基底细胞系表达NECTIN4 mRNA 和蛋白，包括 647V 和 UMUC-14 细胞。尽管 647V 细胞对恩诺单抗相对敏感，但 UMUC-14 细胞具有高度抵抗力，这表明可能还有其他因素会介导恩诺单抗敏感性（即对 MMAE 有效载荷的敏感性）。

泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略的研究有几个重要的局限性。首先，泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略在超过 1,900 个临床样本中的基因表达数据可能不一定反映 NECTIN4 表面蛋白表达。尽管如此，泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略对几种可用细胞系的表面蛋白表达数据证实 mRNA 和蛋白质表达水平强烈相关，这与之前证明 mRNA 和蛋白质水平之间相关性的研究一致。此外，根据转录组表达数据，使用膀胱癌 TMA 对 NECTIN4 蛋白进行的免疫组织化学染色表明，在管腔亚型中具有更高的 NECTIN4 H 评分。其次，在这些队列中分析的样本是从原发性肿瘤组织中获得的（由于数据可用性），可能不一定代表转移性肿瘤中的表达水平。需要对转移部位的活组织检查进行额外研究，以更好地表征原发性肿瘤和转移瘤之间NECTIN4表达的异同。此外，不同转移性病灶之间可能存在患者体内表达的异质性，这在分析单个活检时未被充分认识。虽然泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略的数据表明NECTIN4之间存在相关性EV 在实验系统中的表达和反应，未来的研究应该旨在将泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略的发现与临床患者在局部和转移环境中对恩诺单抗的反应相关联，并确定反应所需的表达阈值。最后，必须承认二维细胞培养的固有局限性，因为这些条件不能概括体内肿瘤微环境和细胞间相互作用。未来应继续研究三维细胞培养和患者来源的类器官模型。

可能存在对 ADC 治疗的多种耐药机制，包括靶标表面蛋白表达的下调（即“抗原逃逸”）。例如，HER2表达降低已被证明是HER2靶向 ADC 的潜在耐药机制，例如用于转移性乳腺癌的曲妥珠单抗 emtansine。用 CD19 靶向 ADC 和嵌合抗原治疗的 B 细胞恶性肿瘤患者的 CD19 缺失受体 (CAR)-T 细胞已被描述。鉴于NECTIN4的明显异质性表达，引发细胞死亡所需的表达阈值也很重要，需要阐明。其他耐药机制可能共存，包括受体内化减少、药物外排泵增加、内体运输发生变化或对有效负载的敏感性降低。最近的 CRISPR 筛选鉴定出许多内体蛋白，包括 C18ORF8 / RMC1，是必需的用于 ADC 功效。有必要对恩诺单抗治疗前后的肿瘤进行进一步调查，以确定其他耐药机制。基底型和其他非腔型尿路上皮癌患者是否对恩诺单抗更具抵抗力仍有待确定。此外，在新辅助治疗中，迫切需要针对 luminal 亚型的策略，因为这些肿瘤从铂类化疗中获益较少。未来的EV临床试验应考虑结合分子亚型来预测治疗反应，并探索EV 在新辅助、辅助和膀胱内治疗环境中早期疾病状态中的疗效。

基因解码基因检测对膀胱癌等尿路上皮癌靶向药物的选择作用

泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略的研究表明，NECTIN4 mRNA 表达在膀胱癌的管腔亚型（LumNS、LumP 和 LumU）中最高，并且在新辅助顺铂治疗后的管腔肿瘤中持续升高。NECTIN4表达与几种管腔转录因子的表达相关，包括GATA3、FOXA1和PPARG。在膀胱癌的细胞系模型中，NECTIN4表达水平与恩诺单抗敏感性相关。此外，在人管腔膀胱癌细胞系中，EV 诱导的细胞死亡需要NECTIN4 ，并且可以通过表达NECTIN4来诱导恩诺单抗敏感性在基底膀胱癌细胞系中。评估恩诺单抗疗效的临床试验应强烈考虑在治疗前对患者进行分子亚型分类。

恩诺单抗（Enfortumab Vedotine）基因检测靶向治疗膀胱癌的要点

Enfortumab vedotin (EV) 是一种靶向 NECTIN4 的抗体药物偶联物，最近被批准用于治疗难治性转移性尿路上皮癌。NECTIN4 是一种与细胞间粘附有关的细胞表面蛋白，被认为在原发性膀胱肿瘤中普遍表达。然而，在早期的临床试验中，EV 的反应率一直存在差异。泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略试图确定NECTIN4表达是否在膀胱癌的分子亚型中存在异质性。使用来自 7 个临床队列和 >1,900 个患者样本的基因表达数据，泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略发现与基础、神经内分泌或富含基质的亚型相比，NECTIN4表达在膀胱癌的管腔分子亚型中最高。连接蛋白4表达对于尿路上皮癌管腔和基底细胞系模型中的恩诺单抗敏感性以及NECTIN4的下调诱导对恩诺单抗的抗性既是必要的也是充分的。泌尿科肿瘤治疗的靶向药物策略的研究结果支持使用分子亚型来预测恩诺单抗反应，并可能对临床试验中的患者选择和生物标志物开发产生影响。