【佳学基因检测】抑癌基因检测及抗肿瘤靶向药物治疗

抑癌基因检测及抗肿瘤靶向药物治疗导读：

癌症是由两种基因的遗传和表观遗传变化积累引起的疾病：肿瘤抑制基因（TSG）和原癌基因。在过去的几十年中进行了广泛的研究，以阐明 TSG 在癌症发展中的作用。根据 Knudson 的两次打击模型假设，在癌症中，TSG 功能的丧失是通过两个等位基因的缺失或失活而发生的。很明显，TSG 的突变在单个细胞水平上是隐性的。因此，TSG 中的单个突变不足以引起致癌作用。然而，许多研究已经确定了不符合该标准定义的候选 TSG，包括通过表观遗传沉默而不是通过缺失而失活的基因。此外，泛素化引起的蛋白酶体降解、异常的细胞定位、和转录调控也参与了 TSG 的失活。这篇综述将这些新的 TSG 失活机制纳入现有的两次打击模型中，并提出了一种修订的多重打击模型，该模型将能够识别可用作癌症预后和预测生物标志物的新型 TSG。

介绍

许多不同癌症的基因研究已经确定了少数必须突变或改变以促进恶性细胞生长的基因[ 1 ]。癌细胞的两个主要特性，不受控制的细胞生长和侵入其他组织的能力，是这些遗传和表观遗传变化的结果。遗传交替包括基因突变、基因组不稳定性、杂合性丢失 (LOH) 和基因拷贝数变异 (CNV)。相比之下，表观遗传变化包括组蛋白修饰、DNA 甲基化和印记丢失 (LOI)。这些修饰在不改变潜在核苷酸序列的情况下调节基因表达[ 2-4 ]。

一般来说，癌症相关基因可以分为两大类，原癌基因和肿瘤抑制基因（TSG）。原癌基因通常参与促进细胞生长的途径。当这些基因被突变或改变激活时，它们会导致正常细胞癌变。原癌基因的突变通常在自然界中占主导地位，这些基因的突变版本被称为癌基因 [ 5 ]。TSGs被认为是另一种关键基因，参与DNA损伤修复、抑制细胞分裂、诱导细胞凋亡和抑制转移。因此，TSGs 功能的丧失会导致癌症的发生和进展 [ 6]。先前的研究表明，一个 TSG 副本足以控制细胞增殖。因此，TSG 的两个等位基因必须永久失活或丢失才能导致肿瘤发展 [ 7 ]。此外，根据具体情况，一些基因既可以作为原癌基因也可以作为 TSG。TSG 大致分为五种类型： 1) 编码细胞内蛋白质的基因，控制进入细胞周期的特定阶段（例如 pRB 和 p16）[ 8 ]；2) 编码受体或信号转导的分泌激素或抑制细胞增殖的发育信号的基因 [例如，转化生长因子 (TGF)-β 和腺瘤性结肠息肉 (APC)] [ 9]; 3) 编码检查点控制蛋白的基因，这些蛋白触发细胞周期停滞以响应 DNA 损伤或染色体缺陷[例如，乳腺癌 1 型易感蛋白 (BRCA1)、p16 和 p14] [ 10 ]；4) 编码诱导细胞凋亡的蛋白质的基因（例如，p53）[ 11 ]；5) 编码参与修复 DNA 错误的蛋白质的基因 [例如，p53 和 DNA 错配修复蛋白 2 (MSH2)] [ 12 ]。

TSG失活是导致癌症发展的常见机制。分子研究表明，TSGs 的失活通常与细胞遗传学上无法检测到的微缺失有关，这些微缺失是通过显示在肿瘤抑制基因座内或附近的多态性标记的 LOH 来确定的 [ 13 ]。TSG 中的种系突变是大多数已知的可遗传癌症形式的原因，因为一个等位基因的体细胞失活通常与正常发育相容 [ 14 ]。此外，启动子甲基化也有助于 TSG 的失活 [ 15 , 16 ]。迄今为止发现的大多数 TSG 都遵循上述 Knudson 范式（表1）。这些 TSG 在细胞水平上是隐性的，并且两个等位基因都被癌症中的甲基化删除、突变或沉默。然而，对人类肿瘤标本的研究越来越多的证据表明，通过蛋白酶体降解、异常细胞定位和转录调控等细胞机制使 TSG 功能失活也可能导致肿瘤发生。本综述概述了不遵循经典 Knudson 两次打击假设的已知 TSG 的失活机制。这些 TSG 的分子分析可能会揭示特定癌症亚类的新靶点。

表格1:抑癌基因的位置和功能

泛素-蛋白酶体降解途径

必须严格调节由 TSG 和癌基因编码的蛋白质的细胞水平，以防止癌变和恶性进展。TSG 产物的水平通常由泛素-蛋白酶体途径控制，这是一种特定的细胞蛋白水解机制。E3泛素连接酶通过与泛素激活酶E1和泛素结合酶E2的协同作用，催化其特定蛋白底物的多泛素化，然后修饰的底物被26S蛋白酶体降解[ 17 ]。由于泛素化-蛋白酶体途径功能障碍或 E3 连接酶异常表达导致的 TSG 产物降解增强可能与肿瘤发生有关。例如，下面讨论了通过泛素-蛋白酶体降解使 TSG 功能失活。

泛素-蛋白酶体降解使 p53 TSG (TP53) 失活

p53 TSG (TP53) 在大多数癌症中失活 [ 18 , 19 ]。它负向调节细胞周期并参与基因组稳定和血管生成 [ 18 , 19 ]。在人类癌症中经常报道纯合缺失 (HD)、LOH、点突变和/或甲基化导致TP53失活（表 2-9）。除了这些遗传失活机制外，细胞 p53 水平还通过泛素化介导的降解进行调节 [ 20]。许多含有环指结构域的 E3 连接酶，包括小鼠双分钟 2 同源物 (MDM2)、MDM4、疱疹病毒相关泛素特异性蛋白酶 (HAUSP)、组成型光形态发生 1 (COP1)、Pirh2 和 ARF-BP1，可以泛素化第 53 页 [ 21 - 25 ]。然而，MDM2 似乎是主要的调节因子，因为MDM2缺乏症的致死性可以通过TP53的损失来挽救[ 21 , 26 ]。通过与 MDM4 的异二聚化，MDM2 对 p53 的 E3 连接酶活性显着增加 [ 21 , 26 ]。在大约 10% 的肿瘤中观察到MDM2的基因扩增[ 21 ,26 ]，其中大部分保留了野生型TP53。在一些肿瘤细胞中，即使在没有MDM2基因扩增的情况下，也会出现 MDM2 的过表达 [ 27 ]。此外，在大约 10% 的所有肿瘤和 65% 的视网膜母细胞瘤中发现了MDM4的过表达 [ 21 , 28 ]。病毒也可能促进 p53 的降解。人乳头瘤病毒 E6 蛋白与 E3 泛素连接酶的 E6 羧基末端 (HECT) 结构域同源形成复合物，导致 p53 泛素化和降解 [ 21 , 29 , 30]。这些发现与泛素-蛋白酶体途径通过p53功能丧失促进肿瘤发生的观点一致。

表 2。

肿瘤抑制基因在白血病和脑癌中的表达和失活机制。注：“—”未找到报告；“HD”纯合性缺失；“NS”无显着差异；平均百分比是使用总病例除以阳性病例计算的

表3。

抑癌基因在头颈癌和肺癌中的表达及失活机制。注：“—”未找到报告；“HD”纯合性缺失；“NS”无显着差异；平均百分比是使用总病例除以阳性病例计算的

表 4。

肿瘤抑制基因在癌症中的表达和失活机制。注：“—”未找到报告；“HD”纯合性缺失；“NS”无显着差异；平均百分比是使用总病例除以阳性病例计算的

表 5。

表 6。

表 7。

表 8。

肿瘤抑制基因在乳腺癌和卵巢癌中的表达和失活机制。注：“—”未找到报告；“HD”纯合性缺失；“NS”无显着差异；平均百分比是使用总病例除以阳性病例计算的

表 9。

抑癌基因在宫颈癌和子宫内膜癌中的表达及失活机制。注：“—”未找到报告；“HD”纯合性缺失；“NS”无显着差异；平均百分比是使用总病例除以阳性病例计算的

通过泛素-蛋白酶体降解使 INK4A/ARF 失活

p16 INK4A和 p14 ARF是经过充分研究的促凋亡蛋白，因为它们在细胞周期停滞和细胞衰老中的关键作用，以及它们与恶性肿瘤的关联[ 31-33 ]。许多研究已经调查了人类癌症中INK4A/ARF基因座失活的机制（表 2-9）。与 p53 一样，p14 ARF是多泛素化和蛋白酶体降解的直接靶标。p14 ARF与 MDM2 特异性结合，MDM2 具有 E3 连接酶活性并诱导 MDM2 的蛋白酶体降解。因此，p14 ARF通过诱导 MDM2 的降解来稳定转录活性 p53 [ 34 , 35 ]。同样，MDM2 在几种癌细胞系中的过表达会通过蛋白酶体导致 p14ARF 降解 [ 36 ]。因此，已在许多癌症中发现 p14ARF 介导的 p53 通路机制破坏 [ 37 ]。

通过泛素-蛋白酶体降解使 TGF-β 家族基因失活

TGF-β 家族的成员是多功能蛋白，它们在许多细胞过程中发挥着重要作用，包括细胞生长、存活、分化、迁移和凋亡 [ 38 ]。其下游信号通路的改变与多种疾病有关，包括癌症 [ 38 ]。在 TGF-β 通路成员中，TGF-β 受体 I、TGF-β 受体 II、SMAD4 和 SMAD2 被认为是经典的 TSG。在某些癌症中，TGF-β 信号传导因 TGF-β 信号通路成分的体细胞突变而被破坏（表2-9）。E3泛素连接酶在26S蛋白酶体识别和降解TGF-β家族靶蛋白中起重要作用。SMADs 的泛素化调节 TGF-β 信号传导；SMAD 泛素调节因子 (Smurf1, Smurf2)，一种 HECT 型 E3 泛素连接酶和 ROC1-SCF Fbw1a，一种 RING 指型 E3 泛素连接酶，都参与了 TGF-β 信号成员的蛋白酶体降解 [ 39 , 40]。Smurf1 和 Smurf2 通过抑制性 SMAD、SMAD6 和 SMAD7 与 TGF-β 家族受体结合，诱导其泛素依赖性蛋白降解。因此，调节 TGF-β 家族肿瘤抑制因子的 E3 泛素连接酶的失调可能导致各种癌症的癌变和恶性进展。因此，了解 TGF-β 和/或其下游信号传导介质的状态为使用选择性抑制剂创造了机会。

肿瘤抑制蛋白的错误定位

肿瘤抑制蛋白受到多种事件的调节，以避免异常细胞增殖、促进细胞凋亡或两者兼而有之。肿瘤抑制蛋白的易位提供了在特定细胞区室之间转导信号的有效手段。某些肿瘤抑制蛋白在正常细胞和癌细胞中显示出不同的定位模式，并且已显示肿瘤抑制蛋白信号传导的时空动力学受损与癌变和恶性进展有关 [ 41 , 42 ]。接下来，我们讨论肿瘤抑制蛋白的错误定位如何导致肿瘤发生的几个例子。

通过错误定位使 RB1 失活

RB1被认为是经典的 TSG。该基因编码的蛋白质是细胞周期的负调节因子。在各种癌症中通过体细胞突变、缺失或表观遗传沉默使RB1失活总结在表 2-9中。低磷酸化 pRB 结合并抑制 E2F 家族成员的转录活性，这些成员控制细胞周期进程所必需的基因的表达 [ 43 ]。相比之下，被细胞周期蛋白依赖性激酶 3 (CDK3)/细胞周期蛋白-C 丝氨酸磷酸化的 pRB 已被证明有助于 G0 阻滞细胞重新进入细胞周期。由输出蛋白 1 介导的核输出导致细胞质错误定位的 pRB 也可能促进肿瘤形成 [ 44, 45 ]。此外，一些pRB相关蛋白也会影响其亚细胞定位。A 型核纤层蛋白 (lamin A/C) 是核基质的核心成分，可以束缚 pRB 并导致细胞周期停滞 [ 46 ]。相比之下，细胞周期蛋白 E 和猿空泡病毒 40 (SV40) 大 T 抗原的共表达通过破坏 pRB 的核积累使 pRB 失活 [ 47 ]。另一份报告显示，pRB 从细胞核的输出受其与 exportin-1 的结合调节，这取决于 CDK 介导的 pRB 在 C 末端磷酸残基的磷酸化 [ 48]。这些数据表明 pRB 的核质错误定位可以通过抑制 CDK 活性而有效地逆转。因此，CDK 抑制剂在人类癌症中具有巨大的临床潜力和前景。

错误定位导致 TP53 失活

p53 是一种转录因子 (TF)，可激活参与细胞周期检查点或细胞死亡以响应 DNA 损伤的应激反应基因 [ 49 , 50 ]。然而，在几种类型的癌症（包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、视网膜母细胞瘤和神经母细胞瘤）中，野生型 p53 由于亚细胞定位异常而失活 [ 51 ]。在这些情况下，p53 的功能和活性保持不变。p53 包含一个核输入/定位信号 (NLS) 和一个核输出信号 (NES)，它们通过核转运受体介导 p53 易位进入细胞核。例如，p53 的功能也受到亚核水平的早幼粒细胞白血病核小体 (PML-NB) 的调节 [ 52]。PML 蛋白与 PML-NB 内的 p53 和环 AMP 反应元件结合蛋白 (CREB) 形成稳定的复合物，并促进 p53 乙酰化，从而促进细胞凋亡 [ 53 ]。在许多人类癌症中已经报道了 PML 的丧失，因此 p53 的功能失活可能是由 PML-NB 破坏诱导的异常亚细胞定位引起的。此外，p53 的一些翻译后修饰，例如 sumoylation、糖基化、neddylation 和核糖基化，也调节 p53 亚细胞定位 [ 54]。p53 在细胞核中的积累导致细胞周期停滞、衰老和凋亡。因此，最近的癌症治疗策略试图通过增强稳定性来诱导野生型 p53 核保留或 p53 蛋白的积累，从而导致细胞凋亡 [ 55 , 56 ]。

错误定位使 BRCA1 失活

家族性乳腺癌易感基因BRCA1编码具有肿瘤抑制活性的 220 kDa 可磷酸化 TF。BRCA1 在多种生物学途径中发挥重要作用，包括转录调节、适当的基因组修复、细胞增殖和凋亡 [ 57 ]。表2-9 总结了在各种癌症中通过体细胞突变、缺失或表观遗传沉默导致BRCA1失调的报告. 此外，BRCA1 的亚细胞定位在其抑癌功能中起重要作用。许多乳腺癌和卵巢癌细胞系和原发性肿瘤表现出高水平的细胞溶质 BRCA1。BRCA1 的环指元件通过与其结合伙伴 BRCA1 相关的环结构域蛋白 1 (BARD1) [ 58 ] 结合来介导核输入。BRCA1/BARD1 异二聚体的结构预测 BRCA1 NES 位于介导 BRCA1 穿梭到细胞质中的环指结构域内 [ 59 ]。这增加了 BARD1 结合掩盖 BRCA1 N 末端的 NES 并阻止与染色体区域维持蛋白 1 (CRM1) 结合的可能性，从而导致 BRCA1 的核保留 [ 59]。具体来说，BRCA1 C 末端的癌症相关种系突变将其限制在胞质溶胶中并抑制其核功能，特别是对 DNA 损伤的反应 [ 57 , 59 , 60 ]。此外，尚不清楚其他 RING 指结构域结合蛋白，如 BRCA1 相关蛋白 1 (BAP1) 是否也与 BRCA1 相互作用以抑制其对细胞生长的控制。在癌症的背景下，对 BRCA1 的细胞内穿梭及其由体细胞突变引起的错误调节如何改变其活性的研究可以为新的临床应用提供见解。

错误定位导致 APC 失活

已在许多人类癌症中报告了因突变、表观遗传沉默或启动子高甲基化而导致的 APC 丢失（表 2-9）。这种肿瘤抑制因子通常定位于健康细胞的细胞质内，但已显示定位于人类癌细胞的细胞核 [ 61 ]，在那里它与致癌产物 β-连环蛋白结合并输出 [ 62 ]。APC 在 N 末端附近包含两个经典 NLS 和两个功能性 NES，它们通过与 exportin-1 的关联介导细胞核和细胞质之间的穿梭 [ 63 , 64] _ENREF_58。细胞增殖过程中 APC 的直接调节来自酪蛋白激酶 2 (CK2)，它在 N 端与 APC 结合并使其磷酸化，导致其核转位 [ 65 , 66 ]。此外，APC 的亚细胞定位受其结合伙伴的调节。APC 的其他核结合伙伴是蛋白酪氨酸磷酸酶 PTP-BL、TF 激活蛋白-2α (AP-2α) 和核输出因子 exportin-1 [ 66 ]。最近对小鼠模型的研究表明，核 APC 通过抑制肠道组织中的经典 WNT 信号传导来调节上皮细胞增殖，这表明 APC 的亚细胞分布在癌症进展中起重要作用 [ 67]。已经开发了几种旨在恢复 APC 定位及其在 Wnt/β-连环蛋白信号传导中的功能的治疗方法。

错误定位使 SMAD4 失活

Mothers against decappentaplegic homolog 4 ( SMAD4 ) 是一种与胃肠道癌变相关的 TSG。作为 TGF-β 信号家族的一员，SMAD4 参与许多细胞功能，包括分化、凋亡和细胞周期控制 [ 68 , 69 ]。在人类癌症中，SMAD4基因可因突变或 LOH 受损或因基因缺失而沉默（表2-9）。此外，SMAD4的异常亚细胞分布也可能导致其功能丧失。先前的一项研究表明，在未受刺激的细胞中，其 MAD 同源 1 (MH1) 结构域中的 NLS 和其接头区域中富含亮氨酸的 NES 都具有组成型活性，因此 SMAD4 在细胞核和细胞质之间不断穿梭[ 70 ]。SMAD4 NES 的激活依赖于 exportin-1，而 SMAD2/3 从细胞核的输出显然与这个因素无关 [ 71 ]。用输出蛋白-1 抑制剂细霉素 B (LMB) 处理细胞会导致 SMAD4 在细胞核中快速积累，这证实了 SMAD4 是由这种特定的输出蛋白输出的 [ 71]。此外，某些保留因子，包括微管 [ 72 ] 和核输入蛋白，例如 E26 转化特异性 (ETS) 相关的 TF (ELF) [ 73 , 74 ]，也与亚细胞分布的调节有关。 SMAD4。此前，我们发现，在晚期胃癌中，41% 的 SMAD4 核染色呈阴性的样本具有中度至高度的细胞质 SMAD4 染色。这种 SMAD4 积累模式与 SMAD2/3 的细胞质积累相关 [ 75 ]。因此，核质穿梭失调可能是导致核 SMAD4 功能丧失的另一种机制。

TF调节

TFs是细胞增殖的关键驱动因素，并维持促凋亡基因和抗凋亡基因的表达平衡。这些因子通常与转录机制的特定增强子元件和/或其他蛋白质结合，并且还可以直接募集共激活因子或共抑制因子和 RNA 聚合酶 II，从而导致肿瘤发生中涉及的关键调控基因的表达或抑制。在这里，我们提供了一些被异常 TF 调节灭活的 TSG 的基本概述。

异常 TF 调节导致 CDH1 失活

E-钙粘蛋白 (CDH1) 是一种细胞粘附分子，对于维持上皮细胞层中细胞-细胞接触的完整性至关重要 [ 76 ]。CDH1的缺失增强了上皮肿瘤细胞的侵袭性 [ 77 ]。由于CDH1基因突变、LOH 或表观遗传启动子甲基化，CDH1 的失调发生在许多人类癌症中（表 2-9）。CDH1基因的高甲基化和染色质重塑已成为导致CDH1下调的主要机制在大多数癌症中。最近有报道称，CDH1 表达的失调也有助于癌症的进展。Snail 家族 TF，包括锌指因子 Snail 和 Slug，在CDH1的转录抑制中发挥重要作用，并通过在入侵过程中改变基因转录来诱导上皮-间质转化 (EMT) [ 77 ]。双手锌指蛋白 ZEB1 和 ZEB2 以及基本螺旋-环-螺旋 (bHLH) 家族蛋白 E12/E47 也能够抑制CDH1的表达。TWIST1 是CDH1的转录抑制因子，在浸润性小叶乳腺癌中，TWIST1 和 CDH1 表达呈负相关[ 77 ]]。这些发现表明 TWIST1 与肿瘤细胞内渗有关，这是肿瘤细胞进入循环以播种转移的过程。最近，另一项研究表明，肿瘤抑制因子 Kruppel 样因子 6 (KLF6) 直接反式激活CDH1启动子 [ 78 ]。这些综合发现突出了多种机制，通过这些机制异常的 TF 调节可导致CDH1基因失活。

异常 TF 调节使 PTEN 失活

10 号染色体上的磷酸酶和张力蛋白同源物 ( PTEN ) 是位于染色体 10q23.31 的有效 TSG。在许多人类癌症中，PTEN因突变或表观遗传机制而失活，而 PTEN 蛋白的稳定性或功能可被其他机制削弱 [ 79 , 80 ]。表2-9总结了 HD 、LOH、点突变或异常甲基化对PTEN的失活。然而，在许多癌症中，PTEN基因是完整的，但似乎是转录沉默的。PTEN 是一种快速降解的蛋白质，半衰期不到 4 小时，似乎在PTEN中发现的许多遗传改变在癌细胞中进一步加速了这种快速降解。苏哈特梅等人。发现早期生长反应 1 ( EGR1 ) TF 直接与PTEN启动子中的共有基序结合并激活基因转录，并且对于响应紫外线和其他应激刺激的PTEN mRNA的上调是必需的[ 81 , 82 ]。此外，Stambolic等人。证明PTEN转录也可以由 p53 诱导，p53 与启动子中靠近 EGR1 结合位点的位点结合 [ 83 ]。TP53 _TSG 是人类癌症中最常见的功能缺失基因。此外，一些报道表明，APE1/Ref-1 通路也调节PTEN的表达[ 84 , 85 ]。因此，这些 TF 的失调可能会使 PTEN 功能失活。

异常 TF 调节使 KiSS1 失活

KiSS1 最初被确定为黑色素瘤中的 TSG。李等人。发现 KiSS1 的表达与黑色素瘤细胞系和临床样本的转移潜力呈负相关 [ 86 ]。后来，在各种转移性癌症中发现了 KiSS1 的丢失或下调，包括卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、膀胱癌、脑癌和前列腺癌，这进一步验证了其在癌症进展中的转移抑制作用 [ 87 ]。LOH、启动子甲基化或基因突变可能是其在部分肿瘤病例中下调的原因 [ 87]。除了上述遗传和表观遗传调控外，TF 的失调也被证明有助于 KiSS1 的下调。先前的研究表明，包括 TCF21、CUX1、YY1、EAP1 和 TTF1 在内的转录因子可以在 mRNA 水平上调节 KiSS1 的表达 [ 88 , 89 ]。最近的研究表明，转移性黑色素瘤中 TCF21 的缺失会导致 KiSS1 的下调，从而导致转移 [ 88 ]。此外，在急性髓性白血病中也报道了 CUX1 的失活 [ 90]。因此，上述表明 TFs 异常调节的数据将成为灭活 KiSS1 基因的额外打击。因此，更好地了解调节 TSG 表达的多种机制及其在癌症进展中的作用将增强当前的治疗策略。

结论

许多报告表明，遗传和表观遗传事件导致 TSG 表达丧失的“两次打击”模型并不能完全解释 TSG 在人类癌症中的失活。因此，我们提出了一种用于 TSG 失活的修订“多次打击”模型，其中包括非遗传/表观遗传事件，例如转录调控、蛋白酶体降解或异常核质穿梭（图 1）。这种修改后的“多重打击”模型在分子水平上结合了 TSG 的失活，可以为抗癌治疗提出新的靶点。

图。1。

人类癌症中肿瘤抑制基因功能丧失的“多重打击”模型的简要总结。

(责任编辑：佳学基因)