【佳学基因检测】造血干细胞基因编辑的临床应用

造血干细胞基因编辑治疗的临床应用现状

HSC加工方法的进步，加上越来越多的基因编辑工具，使人们对疾病的分子机制有了新的认识，并为多种疾病的治疗开辟了新的领域，因此基因编辑已被用于多种治疗方法，包括纠正致病点突变，通过靶向整合将治疗基因添加到特定的基因组位点，去除或破坏突变等位基因，或调节疾病修饰基因的表达。因此，在过去的十年中，有大量的研究（表2）和13项临床试验（表3），通过结合人类原代造血细胞和基因编辑工具来治疗非恶性疾病。

3.1. 血红蛋白病-β-地中海贫血与镰状细胞病

β-血红蛋白病、β-地中海贫血和镰刀细胞病（SCD）代表全世界最常见的单基因疾病，估计每年有56000和270000例患病新生儿出生[185]。对于β-地中海贫血，HBB基因突变减少或者是消除β-珠蛋白的合成。对于SCD, 基因突变编码合成有害的β-珠蛋白变体的形成（HBB:c.20A>T，成熟蛋白中的p.E6V）。β-珠蛋白是成人血红蛋白（HbA，α2β2）的一个关键成分，在没有这种成分的情况下，会形成有毒的α4同四聚体，产生的HbA不足。基因解码发现，HBB中有300多种β-地中海贫血突变，与α-/β-珠蛋白链产生不平衡、祖细胞和红细胞凋亡增加、红细胞生成无效和贫血有关[186]。尽管基于常规治疗（如终生输血、铁螯合治疗地中海贫血和羟基脲治疗SCD）的患者生存率有所提高，但由于输血依赖性和伴随的并发症，患者的生活质量显著降低。

与可以采用HSCT治疗的其他疾病相比，血红蛋白病以及致病基因清晰的和潜在致命性的单基因疾病由于患者人数众多，促使了不成比例的大量往往是开创性的基因治疗研究的发展。第一代先进的治疗药物（ATMPs）主要基于慢病毒介导的将正常的HBB样基因拷贝添加到HSC中，并为自体基因修饰的HSC对β-血红蛋白病的治疗潜力提供了概念证明[10,11,12,13187]。然而，除了常见的HSCT相关的与骨髓清髓相关的风险，由于随机整合而导致的插入突变是一个额外的挥之不去的担忧。2021年2月，这促使蓝鸟生物（Bluebird Bio）基于慢病毒的Zynteglo的试验和销售暂时中止，随后，对一例急性髓系白血病和一例最初怀疑的骨髓增生异常综合征病例之间因果关系的怀疑被消除[188]。对插入突变的关注成为新基因疗法的开发工作长期以来的关注焦点。这种疗法虽然仍然依赖于骨髓消融以支持体外HSC为基础的策略，但本质上并不构成插入突变的风险，对于无DSB的方法，甚至可以消除意外重组事件的风险[29,30]。

β-血红蛋白病的基因编辑疗法主要基于三种方法，包括（i）通常基于HDR的致病突变校正，（ii）向内源性位点添加HBB转基因或（iii）破坏γ-珠蛋白基因（HBG1和HBG2）转录抑制所需的基因或控制元件。至于（i）基因校正，大多数旨在直接校正致病突变的研究针对SCD突变（HBB:c.20A>T）或东亚和东南亚最常见的β-地中海贫血致病突变（HBB:c124-127del）[81,106,107,131,132,133,134,136,137,138,142]。对于这些和其他基因，点突变的校正通常依赖于CRISPR/Cas9系统和ssODN进行基于HDR的校正[81,107,132,136,137,138,141]，尽管也采用了基于NHEJ的开放阅读框架外突变编辑[152189190]和碱基编辑[191,192]。值得注意的是，Hoban等人使用ZFNs对SCD患者来源的HSC中的β-珠蛋白基因座进行基于HDR的编辑，其中在IDLV和ssODN供体模板之间，使用100 bp的较长反向链ssODN实现了最高水平的修饰[82]。至于（ii）基因添加，在突变特异性校正的同时，一些研究小组还评估了HDR介导的HBB转基因靶向插入到内源性位点，作为恢复正常β-珠蛋白水平的更普遍校正方法[106128129139]，进一步优化HDR效率是基因加成治疗的一个更安全、合理的下一步。至于（iii）基因破坏，大量研究关注负责γ-珠蛋白抑制的因子的失活，这反过来导致发育沉默的胎儿血红蛋白（HbF）的表达，α2γ2异源四聚体清除多余的α-珠蛋白，在功能上取代正常成人血红蛋白，并具有抗镰刀特性。利用NHEJ在HSC中的流行性，一些研究小组集中于通过基于NHEJ的HBG1和HBG2基因沉默因子和调节因子的破坏或抑制来重新激活HbF，包括B细胞淋巴瘤11A（BCL11A）、Krüppel样因子1（KLF1）和ZBTB7A，也称为LRF[193,194]。对BCL11A和其他具有多谱系表达的基因进行治疗性开发的一个关键先决条件是确定红系特异性控制元件作为破坏靶点，使其他细胞谱系中的基因功能不受影响[143]。因此，许多研究表明，在核酸酶介导BCL11A基因或其结合位点中的红系控制元件的破坏后，HbF的再激活[91,144,145,146,149]。这些通用方法在证明疾病表型的高效、安全和精确改善方面的成功导致了首次人类临床试验的启动，评估了CRISPR/Cas9（NCT03745287）和后来的ZFNs（NCT03432364）在治疗β-血红蛋白病方面的应用（表3）。

研究小组针对β-地中海贫血和SCD表型所采用的替代方法主要包括模拟与胎儿血红蛋白遗传持久性（HPFH）相关的遗传畸变。在一种罕见的良性疾病中，个体在整个成年期都表达HbF，而在β-血红蛋白病患者中表达HbF可以大大降低症状的严重程度。Traxler等人通过慢病毒CRISPR/Cas递送和对HBG1和HBG2基因启动子中自然发生的13 nt HPFH缺失的近似重演，证明了SCD CD34+HSCs中镰状表型的改善[144]。随后，Lux等人提供TALEN编码的mRNAs来模拟相同的HbF诱导13 nt缺失，从而类似地诱导胎儿血红蛋白[154]。利用CRISPR/Cas核酸酶对，Ye等人在HBB基因座中诱导了12.9-kb的缺失，使HBG1/2基因保持完整，但基本上去除了HBD和HBB，这导致SCD表型的逆转和SCD CD34+HSCs中HbF水平的增加[145]。除了传统的核酸酶介导的基因编辑外，许多研究小组使用了不太传统的策略来靶向β-血红蛋白病，强调了基因编辑技术提供的治疗靶点的多样性。在许多经常显示血红蛋白病但同样适用于其他疾病的独立研究中，核酸酶的DNA结合域已被用于修饰表观遗传标记或创建合成转录或栓系因子[29,30]。从基因编辑到HSC的转录调控和表观基因组编辑，相应的应用范围超出了本文的范围，Wilber等人的一项开创性研究可能仅是例证。将单纯疱疹病毒激活域（VP64）与HBG1/2结合ZF DNA结合域融合，使原代红细胞中的HbF上调至20.9%[195]，这取决于合成转录因子的持续存在。最后，与γ-珠蛋白一样，α-珠蛋白是β-地中海贫血的关键疾病调节剂，因此α-地中海贫血突变的共同遗传导致α-珠蛋白水平降低，从而改善β-地中海贫血表型。这使得Mettananda及其同事在编辑的β-地中海贫血CD34+HSC中能够通过DSB介导的α-珠蛋白增强子缺失恢复正常的α/β-珠蛋白比率[148]，这与γ-珠蛋白本身不能治疗不同，但与额外的治疗剂结合可以改善治疗结果[196]。

重要的是，血红蛋白病也已采用不依赖于DSB的基因编辑方法进行研究。Liang等人很早就利用碱基编辑来靶向中国和东南亚引起β-地中海贫血的三种最常见的突变之一（HBB:c.28（A>G）），尽管不是在HSC中，而是在模拟人类胚胎的细胞系统中[140]。尽管基于碱基编辑器的精确编辑仍然受到近端（旁观者）离靶碱基的无意改变的影响，但是在细胞系中使用基于基序的碱基编辑器已经允许校正HBB−28（A>G）（HBB:c.-78A>G）突变，具有最小的旁观者编辑[192]，对HSC的未来编辑有意义。类似地，高度通用的素数编辑技术被用于逆转SCD突变（一种颠换事件：GTG>GAG，V>E），但迄今为止，这仅在细胞系中得到证实[52]。相比之下，尽管仅限于不能逆转SCD突变本身的过渡编辑，CD34+细胞中的碱基编辑最近被两个里程碑式的研究所采用，这两个研究对SCD治疗的未来和血红蛋白病治疗的临床转化具有潜在的重要意义。首先，针对SCD突变本身并采用一种新的碱基编辑器重新设计PAM需求，Yen等人实现了镰状变体到非镰状变体Makassar的有效转化（GTG>GCG，V>a）[197]。第二，Zeng等人使用碱基编辑使BCL11A红系增强子区域失活，并在地中海贫血CD34+细胞中实现γ-珠蛋白诱导的治疗水平[191]，这是碱基编辑的理想使用案例，旁观者编辑不会造成损害，甚至可能导致靶序列失活。
 

3.2. 原发性免疫缺陷

原发性免疫缺陷（PIDs，也称为先天性免疫错误）是一组异质性疾病，共有130多种罕见的遗传性疾病，与免疫发育和功能异常有关[198]，在全球范围内影响1:10000的活产婴儿。在过去的几年中，包括严重联合免疫缺陷（SCID:X-SCID、ADA-SCID）、Wiskott-Aldrich综合征（WAS）、慢性肉芽肿性疾病（CGD）和X-连锁高IgM（X-HIM）在内的许多原发性免疫缺陷已经通过传统的基于基因添加的方法得到了有效治疗。基于γ-逆转录病毒的X-SCID早期临床试验虽然证明了远远超过常规治疗的有效性和安全性，但在20名儿童患者中有4名患者出现了因为插入突变而引起的白血病[199]。尽管X-SCID中校正细胞固有的选择性优势可能是造成这种现象的原因，该试验促进了人们更加努力地去设计普遍更安全的基因添加载体，并同样继续推动对越来越多的PID的基因编辑研究，以将插入突变风险降至最低[17,43,170,171]。

3.2.1. 严重联合免疫缺陷症（SCID）

SCID以体液免疫和细胞介导免疫缺陷为特征，发病率为1:50000-100000出生，是最普遍的致命的PIDs。其中，Artemis（ART）-、RAG1-和RAG2-SCID在T细胞和B细胞受体成熟所需的重组事件中显示出缺陷。这已通过分别使用编码Artemis的DCLRE1C转基因和RAG1转基因的慢病毒分别进行转导，并在慢病毒基因添加的相关临床试验（NCT03538899和NCT04797260）中针对人类HSPC中的ART-和RAG1-SCID进行了治疗[200,201]。相比之下，X-连锁SCID、X-SCID或SCID-X1，占SCID病例的40%以上，已经通过基于逆转录病毒基因添加的若干临床试验以及基于ZFN和CRISPR/Cas设计核酸酶的大量临床前工作得到解决。X-SCID是由IL2RG基因的遗传畸变引起的，该基因编码白细胞介素-2受体γ链（IL2Rγ），是细胞因子受体的一个常见亚单位，包括IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21[202]。由于IL2RG功能缺乏所引起的细胞因子信号缺陷导致T细胞和自然杀伤（NK）细胞几乎完全缺失，以及功能性B细胞发育受损[203]。在缺乏治疗的情况下，患病男婴在其生命的最初几年因无法抵抗细菌、真菌或病毒感染而死亡。早期基因治疗试验表明，即使HSC纠正率很低，也可能导致正常T细胞免疫功能的实质性重建。迄今为止，针对HSC、IPSC和T细胞的基因校正和添加方法已被用于校正X-SCID相关突变和改善疾病表型[43,98，155，156，158，159]。Sangamo BioSciences领导的一项概念验证研究，使用ZFNs和携带IL2RG外显子5的质粒供体，实现了K562和T细胞中IL2RG基因的功能校正；尽管校正率不高[155]。随后，San Raffaele Telethon基因治疗研究所持续努力，建立理想的培养条件和交付编辑成分的时间，在患者来源的HSC（包括原始HSC）中实现了大量ZFN介导的IL2RG基因敲入置换[43156]。最近，另外两项研究表明，使用ZFNs或CRISPR/Cas9对X-SCID患者源性hsc中的IL2RG位点进行高HDR介导的编辑，利用p53抑制和基于AAV6的供体递送，使得校正细胞对NSG小鼠移植物的贡献高达40%[98，159]。

3.2.2. Wiskott–Aldrich综合征（WAS）

Wiskott–Aldrich综合征是一种罕见的（1:100000出生）X连锁隐性PID，由编码WASP蛋白的WAS基因功能缺失突变引起，WASP蛋白是大多数造血胞系中肌动蛋白细胞骨架和免疫突触形成的关键调节因子[204]。受影响的患者通常表现为血小板减少症、复发性感染和湿疹，并且极易发生肿瘤和自身免疫性疾病。尽管临床上的病人治疗与健康管理有所改进，包括常规血小板输注以及抗生素、抗病毒药物和抗真菌药物的应用，但对于严重型WAS患者，其预期寿命仍仅为15年。利用ZFN介导的WAS转基因整合，为基于基因编辑的WAS校正提供了概念证明，该整合通过编辑患者源性IPSC后进行的[160]。最近，通过结合CRISPR/Cas9和AAV6供体载体，Rai等人在患者来源的HSC中实现了高达60%的治疗性WAS cDNA靶向整合，从而为更有效、更安全的基于编辑的WAS治疗方法奠定了基础[161]。
 

3.2.3. 慢性肉芽肿性疾病（CGD）

由吞噬细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）酶复合物的任何亚单位的遗传畸变引起，常染色体隐性（p22phox、p40phox、p47phox和p67phox）或X连锁（gp91phox）慢性肉芽肿性， 是最罕见（1:200000出生）的PID之一。慢性肉芽肿性患者通常表现出对严重细菌和真菌感染的易感性增强，并由于无法解决相应的炎症而处于超级炎症状态。治疗方式包括终身抗生素/抗真菌预防以及采用干扰素-γ进行免疫调节。X连锁CGD占CGD病例的60%以上，是迄今为止所有临床慢性肉芽肿性试验的目标。同样地，常染色体隐性遗传慢性肉芽肿性迄今为止只能通过基于IPSC和细胞系的编辑来解决[168169205]，而一些关于X连锁慢性肉芽肿性的研究已经在HSC上进行了。在2016年的一项研究中，ZFNs和基于AAV6的供体模板实现了编码gp91phox蛋白的CYBB转基因靶向整合到惰性（“安全港”）AAVS1位点，并证明移植后17周细胞在NSG小鼠的骨髓中植入[97]。在采用CRISPR/Cas9与ssODN联合的进一步研究中，同一组最初报告X-CGD患者源性HSC中CYBB 676C>T点突变，在短暂抑制p53介导的细胞凋亡和移植到免疫缺陷小鼠体内之前有12–31%靶向纠正[167]，使用健康供体细胞作为阳性对照，gp91phox阳性的长期再生细胞水平高达80%[89]。
 

3.2.4. 免疫调节性多内分泌肾病X连锁肠病（IPEX）

IPEX是一种罕见的X连锁疾病，全球已知病例不到300例，以T细胞缺陷和自身免疫为特征，由调节性T（Treg）细胞的主要调节因子FOXP3基因突变引起[206，207]。尽管将FOXP3基因添加到具有组成性表达的CD4+T细胞中具有治疗作用，但跨多个亚系的终身校正需要使用HSC进行生理性表达[208,209]。为此，最近通过CRISPR/Cas介导的位点特异性整合到FOXP3内基因的第一个编码外显子中，利用4.4kb HDR供体进行基于AAV6的递送，进行了基于HSC的修复[170]。除了1.3kb的FOXP3 cDNA外，供体还包括截短的神经元生长因子受体（tNGFR），作为临床兼容的选择标记，使tNGFR阳性细胞富集到29±8%，并在NSG衍生小鼠中长期重建免疫系统。免疫系统重建率低，部分原因可能是供体结构中含有1.6-kb tNGRF表达盒[106]。
 

3.2.5. 高IgM综合征（HIGM）

高IgM（HIGM）综合征的特征是缺陷B细胞超突变和重组，这阻止免疫球蛋白类型从IgM转换为其他免疫球蛋白型，从而导致对微生物感染的易感性[210]。作为一组疾病，HIGM 1型到5型是由影响DNA脱氨基（AICDA）、DNA断裂（UNG）和CD40信号（CD40，CD40LG）的基因突变引起的，后者为通过B细胞与T细胞的相互作用来诱导类别转换所需要。大多数HIGM患者为男性，受X 连锁高IgMp综合征影响，由影响T细胞表达CD40配体CD4OL的突变引起。由IPEX引起的HIGM, 矫正T细胞所提供的治疗效果较短[171],w但是治疗效应又一次的必需依赖在HSC水平上的的矫正，一是因为细胞的寿命，二是对于CD40和CD40LG来说，其他细胞如粒细胞也表达[211]。此外，CD40LG的高度调节瞬时表达似乎是避免恶性肿瘤所必需的[212]。为了解决HIGM1的所有这些问题，Kuo等人利用TALEN和CRISPR/Cas9核酸酶将CD40 LG的cDNA靶向插入内源性CD40LG启动子下游和导致HIGM1的任何已知突变的上游[99]。在这种情况下，基于AAV6的HDR供体递送远远优于基于IDLV的递送，并且对HSC衍生细胞的集落形成分析和大体积培养分析显示，两种核酸酶平台的基因修饰率均高达28%。在体内研究中，移植导致60%的NSG小鼠出现胸腺重建，80%的NSG小鼠出现长期移植细胞阳性，平均整合率为4.4%。鉴于CD40LG/CD40相互作用的动态性质，即使外周细胞中10%的校正也可能促进治疗水平上的类别转换，因此方法上的微小改进可能足以在HIGM1患者中达到临床相关疗效。

 

3.3. 先天性细胞减少/遗传性骨髓衰竭综合征

先天性细胞减少症，即一个或多个HSC衍生细胞系的先天缺失或减少，是由遗传的或者是自发的影响骨髓的胚系突变引起的[213]。这些罕见贫血中最常见的是范科尼贫血（FA）、Shwachman-Diamond综合征、Blackfan-Diamond贫血、先天性角化不良（DC）、先天性无核细胞血小板减少症（CAMT）和网状发育不良。在大多数情况下，尤其是早期治疗，HSCT可显著延长生存期，尽管HSC谱系以外的综合征特征，如FA和DC中的早发鳞状细胞癌，尚未得到解决。同样的局限性也适用于矫正自体造血干细胞的治疗性应用，其中受不同先天性细胞减少（包括FA）影响的造血干细胞具有作为矫正基质的劣势。然而，这可以通过校正细胞明显的体内增殖和存活优势得到补偿[174]。迄今为止，在大多数先天性细胞减少的情况下，基因编辑仅限于在细胞系或模型系统中进行实验[30214]，显著的例外是FA的大量努力和成功（如下所述），以及CAMT CD34+细胞中基于突变特异性CRISPR/Cas修复的原理证明[181]。
 

范科尼贫血

FA是一种罕见的（1:100000）遗传性疾病，其特征是所述22个FANC基因中的一个或多个发生突变，导致DNA损伤反应缺陷、身体异常和进行性骨髓细胞生产不足。受影响的患者通常表现为骨髓衰竭、身体异常和器官缺陷，特别容易发生癌症。早期临床试验强调了从受影响患者中收集和处理自体HSC的挑战，但同时证明了校正后的HSC比来自FA患者的突变HSC具有强大的植入能力和增殖优势[215]。到目前为止，许多研究小组已经利用核酸酶介导的基因编辑作为基于LV的基因添加方法的替代方法[173,174,175,216]。由于FA患者骨髓生态位的广泛损伤以及HSC的数量和质量较差，早期概念验证研究使用FA患者来源的成纤维细胞作为模型，使用CRISPR/Cas9系统靶向FANC突变[173216]。然而，Diez等人除了FA患者来源的细胞系和健康的CD34+细胞外，还使用FA CD34+细胞来证明通过ZFN介导将FANCA供体引入AAVS1“安全港”位点来纠正FA表型的可行性[174]。Corn小组最近强调了有效利用HDR靶向FA致病突变的一个关键障碍，他们证明了FANC蛋白在Cas9介导的单链模板修复[217]和利用双链供体DNA进行基于HDR的修复[218]中的作用。值得注意的是，Román-Rodríguez通过采用NHEJ介导的破坏来引入代偿性突变，从而绕过了这一困难，从而恢复了FANCA、-C、-D1和-D2基因的表达[175]。或者，基于HDR的修复的小分子抑制剂可用于提高HDR效率，即使在FA背景下也是如此[218]。

 

3.4. 遗传性出血和凝血障碍

出血和凝血障碍包括出血时间过长（血友病）和其他凝血速度过快（血栓性/高凝性）的情况，其极端形式可能致命。这两种疾病可以互相解除复杂的血液酶级联反应的调节，该级联反应在没有损伤的情况下通常保持不活动，并且在检测到内皮细胞和内皮下细胞受损时通过血栓形成有效地密封血管壁。血友病和血栓性突变是共同的疾病修饰因子，因此血栓性风险因子的共同遗传导致血友病较温和的表型[219]。对于血栓性疾病，致病突变包括因子V Leiden和2021G>A凝血酶原突变，在罕见但通常更严重的病例中，是抗凝血酶III、蛋白C和蛋白S的突变[220]。对于血友病，X染色体编码凝血因子VIII和IX中总共有1000个以上突变分别引起血友病A和B，而第4号染色体席因子XI突变引起血友病C[221]。在出血和凝血障碍中，迄今为止所有处于进展期的临床前和临床基因治疗研究都集中于血友病A或B。

 

血友病

凝血因子VIII和IX的自然产生发生在肝脏中，因此大多数已发表的基因治疗方法使用AAV载体在肝细胞中进行体内基因添加或基因编辑[179,222,224]。特别值得注意的是其原量为，在ZFN介导的靶向整合后，在内源性白蛋白基因启动子的控制下，因子VIII和IX的cDNA表达原理[225]。然而，有几种新方法采用体外操作HSC来研发治疗方案[226]。例如，基于HSC的慢病毒基因添加方法的临床试验包括系统表达因子VIII或IX[227228]和表达血小板保留因子VIII，以避免因子VIII不必要地暴露于免疫系统[229]。编辑方法现在利用了HSC衍生表达的相同原理，包括在内源性α-珠蛋白启动子控制下靶向整合因子IX cDNA[162]，其中，可分散因子的高水平表达可补偿低整合效率和低嵌合的经过编辑的长期再植入HSC。
 

3.5. 血液之外

除了应用于血液疾病外，HSCT还可以在噬血细胞疾病中替代作用于实体器官的吞噬细胞，或在代谢疾病或蛋白质缺乏症中终身提供或其他蛋白质治疗[3]。在所有这些情况下，基于对自体造血干细胞甚至超越造血干细胞的衍生组织的修饰，基因治疗和基因编辑可能再次获得与传统造血干细胞移植相同的治疗效果，但不存在与异基因移植相关的风险。在血液循环之外，基于HSC的蛋白质递送的绝大多数研究和成功都是针对先天性代谢紊乱的，但新的靶点正在出现。

3.5.1. 先天性代谢错误（IEMs）

IEM描述了一大类异质性遗传疾病，通常由酶或转运蛋白缺陷以及共同代谢途径中的相应阻断引起。这会导致大分子的毒性积聚和细胞功能障碍。单一的IEM很少见，但作为一类疾病，IEM的发病率因人群而不同，可高达1:800。苯丙酮尿症（PKU）和中链酰基辅酶A脱氢酶（MCAD）缺乏症（发病率分别为1:10000和1:20000）是最常见的疾病[230]。在更常见的IEM中，溶酶体储存疾病是一组约50种罕见的遗传性代谢紊乱，由溶酶体功能缺陷引起。IEM的其他主要类别是糖原储存障碍和过氧化物酶体障碍[231]。姑息性治疗，例如通过酶替代疗法，成本高昂，且并非普遍有效。与血友病类似，代谢性疾病可通过体内编辑肝细胞和内源性白蛋白启动子控制下的酶表达来治疗，如在Fabry病、Gaucher病和Hurler和Hunter综合征缺乏蛋白质的小鼠中所证明的[225]。重要的是，在20多年的时间里，对这些疾病采用富酶细胞进行HSCT治疗已经长达20多年。因为缺乏的酶的不同及疾病阶段不同，成功程度不一样[232]。这促使Pavani等人在HSC中进行靶向整合，以解决Fabry病、Wolman病和Hurler综合征潜在的酶缺陷，这与他们在同一研究中α-珠蛋白启动子驱动治疗血友病的凝血酶驱动因子表达的研究一致[162]。至于出血性疾病，HSC的高水平表达和易于操作的潜力可能使HSC衍生的可溶性因子表达对于代谢和其他疾病的未来治疗具有极大的重要性。
 

3.5.2. 神经病

HSC来源的细胞可以通过血脑屏障，从而促进相互作用的工程性改变或蛋白质分泌，具有治疗效果。这一点可以通过释放促凋亡化合物来实现小鼠脑肿瘤的减少[233]。基于基因编辑技术的这一策略最近的一个显著发展是应用于Friedreich共济失调，这是一种由FXN基因中致病性GAA三核苷酸重复扩增引起的神经退行性疾病。将正常HSC移植到该疾病的小鼠模型中，可以将正常蛋白质从HSC衍生的免疫细胞转移到受影响的神经元和心肌细胞，从而产生治疗效果[234]。为了通过移植校正的HSC实现相同原理的临床转化，CRISPR/Cas介导的人类HSC中GAA重复的切除允许正常线粒体功能和细胞的造血分化[235]。

 

3.6. 后天性和复杂性疾病

本综述中的治疗应用和疾病实例集中于HSC编辑在遗传性疾病，特别是单基因疾病治疗中的应用。然而，值得注意的是，HSC和相应谱系的基因编辑也被用于对抗获得性和复杂疾病，包括感染和癌症，最近在其他地方进行了综述[236,237,238,239]。前者的一个突出例子是针对HIV相关获得性免疫缺陷综合征（HIV/AIDS）的抗性改造，其中CD4共受体CCR5和趋化因子受体CXCR4介导不同HIV毒株的感染，并可在T细胞或HSC中编辑或沉默，以使HIV靶细胞对病毒产生抗性[182,183,184,240]。基因编辑在癌症中最突出的应用，具有广泛的临床意义，是在创造嵌合抗原受体T和NK细胞，用于有效的肿瘤免疫治疗[239]。除了应用于治疗之外，HSC中的基因编辑已经有助于全基因组基因筛查，有助于对肿瘤和其他复杂或获得性疾病的潜在途径和驱动基因的理解，HSCT目前被用作对这些疾病治疗方式[241,243,244]。由于单个细胞的逃逸在肿瘤性疾病中是有害的，特别是对于影响HSC及其后代的非肿瘤性复杂疾病的治疗，基因编辑在未来可能具有直接的治疗作用。这些疾病中有许多具有遗传成分或特征的细胞途径变化，作为治疗目标的暂定指标[245,246]。

 

4.临床应用过程中的突出挑战

基于50多年的HSCT经验和无数临床前试验和120多项临床试验的知识，包括通过基因添加进行的基于HSC的基因治疗干预，使用HSC的基因编辑疗法在不到十年的时间内从试验台转移到了床边。除了细胞分离和培养方面的持续技术创新外，基因添加试验和通过建立相应的商业、制造、临床和供应基础设施产品的开创性商业化加快了基因编辑的临床应用，并启动相应监管机构和准则的国际协调[84]。特别是在基因编辑方面，现有的应用已经显示出高度的通用性，以及潜在的安全性和有效性，超出了基因添加所能实现的范围。然而，许多挑战和缺点仍然存在。

 

4.1. 技术挑战和实际限制

高效的HSC细胞内传递、微调的编辑器活性和可编程编辑器的高度特异性是成功临床应用的先决条件。除了编辑技术本身，临床试验方案需要考虑的参数包括HSC来源和质量、患者的健康状况、疾病和修饰基因型以及实验条件方案的选择。在所有这些因素中，细胞材料的选择、适当的培养、编辑的精确性和避免骨髓消融（如通过体内程序）是优化的重要目标。

4.1.1. 细胞产量和组成

根据目前的方案，获得足够数量的造血干细胞进行有效的体外基因改造和后续移植可能并不总是可能的，因为某些疾病会影响骨髓并降低造血干细胞的数量和质量。原始HSC的微妙性质以及在制造过程中浓缩、培养、冷冻和解冻过程可能造成的细胞损失，加剧了这种情况[247]。因此，为了改善LTR-HSC操作和较低的载体需求，需要针对相应的细胞产量损失，对CD34+细胞的HSC特异性亚组进行富集。此外，据报道，输注经基因编辑的造血干细胞和未经基因编辑的造血祖细胞的混合群体可以改善移植和造血重建[75,77]，这些造血祖细胞可能已免于体外培养和基因操作。因此，除了大多数临床试验方案要求少量（1.5–2.0×106 CD34+/kg）未经修饰的造血干细胞在植入失败时作为“后备”储存外，保存和对未操纵的细胞进行祖细胞选择与编辑的细胞联合移植可能会改善自体HSCT后的髓系重建。
 

4.1.2. 保持干性

高效体外编辑HSC需要培养HSC，但已证明对其干细胞特性和植入能力有负面影响。为了克服这个问题，在培养方案中引入了许多干细胞生态位调节因子（PGE2、SR1和UM171），以维持和扩大有助于移植的最原始的具有长期再植入能力HSC部分。包括这些调节物的进一步的临床安全性和可行性研究，将允许评估它们的能力，以确保在无副作用的情况下保存基因编辑的HSC的长期多系潜能[248,249]。

4.1.3. 精密修复

容易出错的NHEJ介导修复的优势和在最原始的HSC中HDR的有限效率一直是HSC基因编辑疗法的一个长期挑战，因为通过碱基编辑的DSB独立精确编辑已经显示出其在HSC精确修复中的临床转化潜力[191，197]并且由于引物编辑开始在原代细胞中实现高效率的精确编辑[250]。为了提高基于DSB的HSC精确编辑，许多研究致力于抑制NHEJ、提高HDR或调节核酸酶活性，而延长活化时间和允许在不损害其功能特性的情况下建立HSC HDR增强条件的最佳条件仍然是难以捉摸的[86,88,251]。此外，去除未经编辑的原始干细胞（可能与经编辑的细胞竞争植入）可能提供一种替代途径，以弥补编辑效率和HDR频率不足[106,113]，尽管使用可选择标记进行移植可能有其自身的缺点[106,170]。
 

4.1.4. 走向更安全的调节和体内编辑

体外HSC编辑与临床试验中的不良事件有关，特别是患者准备已成为多项研究中的一个改进目标。在某些情况下，如X-SCID，使用细胞毒性烷化剂（如白消安）进行完全骨髓消融与治疗相关死亡率升高相关，在X-SCID中，发现使用混合药物进行温和准备足以使B细胞的供体细胞重建[252253254]。其他PID，其中替代条件必须在个体基础上进行评估[254]，血红蛋白病也是如此[255，256]。对于其他疾病，如FA，无需完全准备即可实现有效治疗[14]，而创新的选择性调理方法，如靶向CD117或CD300f的细胞特异性药物递送，以及使用非基因毒性药物，如saporin，正在对一系列疾病进行研究，以将治疗相关的造血恶性肿瘤风险降至最低[55，257，258，259]。

重要的是，使用基于病毒或基于脂质的纳米颗粒对HSC进行体内基因编辑可能完全避免预处理，并可能通过提供潜在更安全和更易于应用的治疗方案在HSC基因编辑疗法方面取得突破。然而，到目前为止，这只应用于小鼠模型[59,62，150]，扩大这一过程将带来新的挑战。这种方法的好处不仅包括其不依赖于骨髓消融和细胞分离程序，而且避免了作为治疗产品的患者特异性修饰细胞周围的物流，尽管目前它的主要缺点包括亚治疗效率和编辑靶细胞甚至生殖细胞的风险。值得注意的是，HSCT治疗的大多数疾病是隐性的，通常与蛋白质数量或功能减少有关。鉴于生物系统中频繁的功能冗余和体内选择的校正细胞，因此仅校正一部分患病细胞通常足以逆转疾病病理学和改善症状。事实上，移植后随访研究表明混合造血嵌合体低至10–30%，与SCD、地中海贫血、SCID和其他PID患者的临床症状改善和不再依赖于输血有关[260，261]。
 

4.2. 安全

基于基因编辑的治疗是一个相对年轻的研究领域，尽管已经取得了显著的成就，但关于长期风险、编辑效应的持续性以及基因编辑的造血干细胞的安全性的数据仍然缺失。从最初用于基因添加的γ-逆转录病毒和慢病毒载体长达十年的临床应用中获得的一个关键教训是，即使在最有责任心和知识最渊博的参与者手中，每一项新的ATMP技术都会带来残余风险和挥之不去的未知因素[262]。此外，在临床基因添加试验的随访期间可能进行的克隆分析揭示了克隆HSC潜伏期的阶段和对血液重建的贡献[73263]，这也将决定基因编辑试验的有效性和长期安全性。展望未来，与基因添加面临的风险密切相关，目前基因编辑技术的主要关注点包括DSB诱导的危险性、编辑细胞的长期稳定性、治疗的免疫原性以及风险与效益的总体比例。

4.2.1. DSB诱导

核酸酶介导的基因编辑可触发细胞内防御机制和下游反应，影响HSC的增殖、存活和分化[264]。特别是，由于传统核酸酶编辑器对高效DSB诱导的固有依赖性，可能会导致p53介导的DNA损伤反应、细胞周期阻滞或HSC干细胞干性的改变，因此产生了安全问题[41,46，265]。几项研究表明，暂时抑制p53会降低DNA损伤反应并增加HDR水平[89,98,159]，但鉴于p53的肿瘤抑制功能，需要进一步的工作来评估使用此类抑制剂的安全性，在这种情况下，即使是特定于目标的DSB依赖性编辑事件也会导致造血异常[46,47,48,49，266]。由于单一靶向DSB事件可能已经引发染色体重排，并可能带来灾难性后果，因此，在序列类似的非靶向位点上的无意切割将加剧重组事件的发生或可能诱发indel形成，可能通过癌基因的反式激活或肿瘤抑制基因的失活导致不良事件。因此，与基因添加的插入突变风险类似，HSC中用于基因编辑的非靶向突变风险因其独特的自我更新和多能性而引起长期安全问题。值得注意的是，nickase介导的碱基和引物编辑工具可能会像基于DSB的编辑器一样显示序列依赖的非靶点活动，但它们在靶点和非靶点诱导DSB和INDEL的倾向性大大降低。因此，在可能的情况下，基于DSB的编辑越来越多地被碱基编辑或引物要编辑技术所取代，尽管后者仍需进行大量优化[267]。

4.2.2. 长期稳定性

在最终的基因编辑产品中实现持续的和治疗相关的校正水平是治疗中最关键的方面之一。尽管据报道在大多数临床前研究中获得了良好的基因编辑产物植入率，但最近的研究表明在移植后8-16周内编辑细胞的频率降低[81,87，106]。这是由于原始造血干细胞的基因编辑效率低下，还是由于它们在体外培养和操作后无法自我更新，仍有待确定。目前，大多数基于HSC基因编辑的临床研究仍处于早期阶段，加上通常较小的样本量，损害了对编辑后的HSC在体内长期行为的一般预测。

4.2.3. 免疫原性

设计核酸酶的体内传递比体外应用面临更大的障碍，因为将外来颗粒引入人体会产生免疫原性，因此患者需要接受免疫抑制治疗。这对于CRISPR/Cas平台的体内基因编辑尤其重要，因为通常预先存在对蛋白质成分的免疫力[109]。因此，除了累积非靶点突变的风险外，长期暴露于Cas9的潜在免疫原性也是编辑成分高度瞬时表达的另一个理由。未来应对基因编辑挑战的其他方法可能是常规免疫抑制方案[268]，治疗前自体调节性T细胞的体外扩增和再融合[269]，或者更根本的是，Cas9的靶向表位消除[270]或其先前不可能存在暴露的Cas9变异体。

4.2.4. 风险获益合理性

与早期X-SCID基因添加试验中白血病病例后基因治疗领域普遍遭受挫折类似，任何基于HSC基因编辑的治疗不良事件都可能危及整个治疗类别的社会支持。此外，支持性治疗的进展以及许多遗传性疾病患者生活质量和生存率的提高要求仔细评估基因编辑疗法与传统疗法相比的潜在风险和益处。对于总是致命的遗传性疾病或对常规治疗无反应的患者，基因编辑的风险策略似乎是可以接受的，而对于其他情况则不会。即使在没有不良事件的情况下，不负责任地使用编辑技术也是不可接受的，并将正确地引起社会反弹，正如2018年完全无偿且技术上有缺陷地使用生殖系编辑来设计产前抗艾滋病毒的情况所观察到的那样[271]。

4.3. 成本和公众访问

在过去十年中，ATMP产品市场大幅扩张，预计到2025年价值将超过112亿美元[272]。然而，ATMPs的高成本阻碍了其广泛应用，这部分是基于对患者和医疗机构支付意愿的精明评估，但也基于高开发和生产成本、高安全标准，与绩效相关的报销模式和目前临床级试剂的短缺。尽管在2009年至2019年3月期间有14种ATMP获得了市场授权，但有四种ATMP因商业原因已被撤回，而基因添加β-血红蛋白病药物Zynteglo因价格分歧刚刚从欧洲最大的单一经济体德国撤回[273]。这些事件表明，在基于HSC的一次性治疗性ATMP的新兴业务中，剩余的关键挑战是获得治疗以及产品和服务的可负担性和商业可持续性。
 

4.3.1. 可及性

尽管投资者和公众越来越感兴趣，但基于基因治疗的ATMP在临床评估和批准后面临的一个主要挑战是成本和患者可及性。驱动高成本的一个主要因素是生产GMP级HSC所需的大量临床（良好生产规范，GMP）级产品。与通常使用0.2–1×106 CD34+细胞进行的研究规模细胞编辑不同，临床规模细胞编辑和移植的目标剂量为2–20×106 CD34+细胞/kg，这消耗了大量昂贵的GMP级试剂和产品开发和质量认证所需的分析。此外，对于一些疾病，可能需要对多个造血细胞系进行体外基因编辑评估，这进一步增加了制造过程的长度和成本。此外，全球只有少数医疗中心在基因治疗和基因编辑治疗方面拥有临床水平的专业知识，这缩短了供应，需要细胞和试剂转移，并进一步限制了患者获得治疗的机会。制药公司和学术界之间日益增强的伙伴关系有助于加速基因编辑技术的临床转化，同时可能会扼杀针对少数患者群体的罕见和可能无利可图疾病的ATMPs开发。此外，许多受遗传性血液病影响的患者生活在发展中国家，如非洲的SCD患者和中东和南洋的许多地中海贫血患者，而ATMP的业务和研究则在别处进行。ATMPs中利益相关者的地理分布，加上相关公司提供投资回报的压力，提出了一个问题，即是否会推动新兴和救生治疗的普及，并使大多数患者负担得起。

4.3.2. 可持续性和负担能力

为了使基于自体HSC基因编辑的疗法满足其潜力，需要开发新的财务模型和报销政策和流程，以使患者能够获得这些治疗，同时允许公司蓬勃发展。遗憾的是，鉴于患者群体规模通常较小，且为个体患者量身定制的制造过程冗长复杂，ATMP通常被视为商业价值低、商业风险高的产品。此外，大多数可通过编辑HSC治疗的疾病都是由多个基因的大量突变引起的，在没有通用疾病修饰剂的情况下，这些突变会成倍增加ATMP开发工作和投资，从而将治疗推向市场和患者。通过体内HSC基因编辑可以降低成本，这将在概念上提供一个更优雅的制造和供应系统，利用可直接给患者服用的现成产品。为了取得进一步进展，需要克服与靶组织特异性、免疫原性、生物分布和疗效相关的主要障碍。类似地，子宫内基因治疗的概念[58,60,61]为早期临床干预提供了机会，大大减少了GMP级试剂的使用，可能为需要资源的体外HSC基因编辑提供了另一种解决方案。为了在这方面取得进一步的进展，需要首先在大型动物模型和新的立法和指南中提供更多的数据。无论如何，支付治疗的意愿不仅要考虑替代治疗的年度和终身成本，还需要考虑由于患者生产力的降低而产生的间接成本以及与患者及其家属的疼痛和心理痛苦相关的无形成本。考虑到社会成本，随着不断发展，进一步降低开发和治疗成本，在未来几年，通过HSC基因编辑进行治疗可能成为越来越多的慢性病患者负担得起和合理的治疗方法。
 

5.结论

HSC的分离、表征和操作方面的巨大进步，加上日益多样化的基因编辑工具组合，为疾病的潜在分子机制提供了新的见解，并为许多疾病的治疗开辟了新的领域，为许多至今无法治愈的疾病的治疗带来希望。HSC与基因编辑工具相结合已经在大量血液学和非血液学疾病的临床前治疗中显示出成功。部分由于可编程核酸酶及其在体内和临床应用的历史相对较短，关于基因编辑产品在患者中的短期和长期副作用仍有许多未知因素。在可能的情况下，需要考虑无DSB技术、短期试剂暴露、LTR HSC编辑和安全细胞处理、治疗前准备或体内治疗方案，以降低患者的潜在风险。相应地，GMP生产的透明度和标准化、临床前安全性和有效性评估以及临床随访都是必需的，更大患者群体的临床试验和更长的随访也需要如此，以确定这些干预措施的长期疗效和安全性。在目前通过基于HSC的基因编辑扩大和改进治疗的轨道上，该技术可能很快成为许多威胁生命的疾病治疗的标准，这反过来又需要标准化的国际监管框架。实现基于HSC的自体基因编辑疗法的前景将取决于临床级试剂和程序的可扩展性，以及这些新疗法对需要的患者和社区的可承受性和可获得性。